Generowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z komórek macierzystych szpiku kostnego

Abstract

Źródło: Xu, L. et al., Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii zastępczej cytoplazmy.J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje metodę generowania pęcherzyków błony plazmatycznej z komórek macierzystych szpiku kostnego poprzez szybkie przepuszczanie ich przez filtr membranowy. Te PMV wykazują potencjał w terapii zastępczej cytoplazmy.

Protocol

1. Montaż aparatu

1. Aby zapewnić sterylność, przed użyciem włącz światło ultrafioletowe (UV) okapu do hodowli tkankowej na 30 minut.
2. Odkręć jednorazową jednostkę filtrującą 25 mm i zanurz nakrętkę i spód urządzenia w szklanym kubku o pojemności 200 ml wypełnionym 75% etanolem na 30 minut. Urządzenie wykonane jest z polipropylenu klasy medycznej.
3. Podnieś nasadkę i spód urządzenia za pomocą kleszczy, ręcznie strząśnij pozostały etanol i pozostaw części do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w masce.
4. Zwilż membranę poliwęglanową o średnicy 19 mm w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ostrożnie umieść ją na matrycy nośnej dolnej części urządzenia. Folia polimerowa ma gładką, płaską powierzchnię i wytrawione pory o wielkości 3 μm.
5. Zmontuj urządzenie, mocno dokręcając nakrętkę do spodu. Upewnij się, że membrana nie jest wysunięta ze środka.
6. Usunąć igłę ze strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i pobrać 1 ml PBS. Podłącz strzykawkę do jednostki filtrującej, a następnie przepchnij PBS przez jednostkę, aby zwilżyć zespół i sprawdzić, czy nie ma wycieków.

2. Wytwarzanie pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV)

1. Ustalić hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC), zgodnie z raportem Nemetha i wsp., w pożywce hodowlanej Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki na 6-dołkowej płytce w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Aby rozmnożyć komórki, usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz studzienkę 0,5 ml bezwapniowego PBS.
3. Dodać 0,5 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (trypsyna-EDTA) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Postukaj płytką o dłoń kilka razy, aby ułatwić oddzielenie komórek. Zatrzymaj trawienie, dodając 1 ml pożywki hodowlanej.
4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej. Zawiesić komórki w 4 ml pożywki hodowlanej i podzielić komórki na dwie studzienki na płytce 6-dołkowej.
   nuta: Komórki zwykle osiągają konfluencję po około 24 godzinach.
5. Aby wytworzyć PMV, należy pobrać komórki z jednego dołka (około 5 x 10⁵ komórek) z 6-dołkowej płytki przez trawienie trypsyną i monodyspersować komórki w 0,5 ml pożywki hodowlanej.
6. Załaduj komórki do strzykawki insulinowej, przymocuj ją do jednostki filtrującej i szybko naciśnij tłok, aby przecisnąć komórki przez filtr. Wytłaczane medium należy wyrzucić, ponieważ powinno się w nim znajdować tylko kilka PMV.
7. Załaduj dodatkowe 0,5 ml pożywki do strzykawki i szybko przepchnij ją przez filtr. Zebrano pożywkę z drugiej ekstruzji, która zawiera PMV o różnych rozmiarach.
8. Załaduj 150 μl zebranego podłoża do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól PMV osiąść na dnie przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem z odwróconą fazą kontrastu wyposażonym w kamerę CCD przy użyciu soczewki obiektywu 20X.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrany IsoporeTM	Milipory	TSTP04700	Pory 3 mm
Jednorazowa jednostka filtrująca	Xinya, Szanghaj, Chiny	25 mm	Polipropylen klasy medycznej
Strzykawka insulinowa	Bd	328446	Pojemność 1 ml