Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Mutageneza UV w celu wytworzenia auksotroficznych szczepów drożdży
- Generowanie krzywych przeżycia w celu określenia potrzebnych dawek promieniowania ultrafioletowego (UV)
- Przygotować pożywkę YPD (ekstrakt z drożdży, dekstroza, pepton) i inne odczynniki wymienione w Tabeli 1 zgodnie ze standardowymi procedurami i zaszczepić pojedyncze kolonie w 5-10 ml pożywki YPD. Inkubować kultury na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N do nasycenia przez co najmniej 8 godzin.
- Określić stężenie komórek w nocnych kulturach (O/N) za pomocą spektrofotometru, rozcieńczając komórki w stosunku 1:10 w wodzie w plastikowej kuwecie. Rozcieńczyć komórki do stężenia 10-7 komórek/ml w 20 ml sterylnej wody destylowanej.
- Rozcieńczone komórki przelać na sterylną plastikową szalkę Petriego i po zdjęciu pokrywki umieścić płytkę 14 cm poniżej żarówki UV.
- Poddać komórki szeregowemu dawkom promieniowania UV 5 000 μJ i 10 000 μJ, ekstrahując 500 μl komórek po każdym inkremenencie, tak aby próbki komórek pobierano po ekspozycji na 0 μJ, 5 000 μJ, 10 000 μJ, 15 000 μJ, 20 000 μJ, 25 000 μJ, 30 000 μJ, 40 000 μJ, i 50 000 μJ promieniowania UV. Przenieś wyekstrahowane próbki komórek do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml i seryjnie rozcieńczaj w krokach co 1:10 w sterylnej wodzie.
- Granulki w każdym rozcieńczeniu przez odwirowanie w mikrowirówce o stężeniu 16 000 x g przez 1 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl objętości sterylnej wody odpowiedniej do posiewu komórek drożdży. Odpipetować całą objętość zawieszonych komórek na płytkach zawierających stałe podłoże YPD i użyć sterylnego rozsiewacza, aby równomiernie rozprowadzić komórki na każdej płytce.
- Owiń krawędzie płyt w Parafilm, aby zapobiec wysychaniu mediów, a płyty przykrywkowe folią aluminiową, aby zapobiec fotoreaktywacji i naprawie mutacji wywołanych promieniowaniem UV. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni, aby umożliwić wzrost żywotnych kolonii drożdży (ryc. 1).
- Policz liczbę rodzin, opcjonalnie za pomocą długopisu do zaznaczania zliczonych kolonii, ręcznego elektronicznego długopisu do liczenia lub stojaka z powiększeniem. Wykreślić jako procent całkowitej liczby posianych komórek przy każdej dawce μJ promieniowania UV, aby wygenerować krzywą przeżycia dla napromieniowanych drożdży (Rysunek 2).
UWAGA: Można się spodziewać, że haploidalne szczepy drożdży będą wymagały niższych dawek promieniowania UV w porównaniu ze szczepami diploidalnymi, aby osiągnąć ten sam procent przeżycia. Szczep drożdży pozbawiony funkcjonalnych enzymów naprawy DNA, taki jak mutant rad1 S. cerevisiae, może być użyty jako kontrola pozytywna wskazująca na obecność promieniowania UV w bardzo niskich dawkach.
- Określić dawkę mutagenezy UV, która ma być stosowana do badań przesiewowych, odnosząc się do krzywej przeżycia ustalonej w ppkt 1.1.7. Wartość x punktu wzdłuż krzywej przeżycia, w którym y jest równe 50, to dawka promieniowania UV, przy której przeżywa 50% drożdży. Badania przesiewowe mutantów przy tak niskim procencie przeżywalności mogą skutkować wyższą wydajnością pomyślnie zmutowanych szczepów, szczególnie w przypadku drożdży diploidalnych. 50% dawka zapewniająca przeżycie dla WT S. boulardii, jak pokazano na rysunku 2, wynosi około 18 000 μJ.
UWAGA: Chociaż tak wysokie dawki promieniowania UV zwiększają ryzyko mutacji w genach szlaków komórkowych innych niż interesujący nas gen markera auksotroficznego, wada ta musi być zrównoważona z potrzebą indukowania mutacji w obu kopiach genu markera auksotroficznego. W przypadku szczepów haploidalnych, w których tylko jedna kopia genu musi być zmutowana, badania przesiewowe przy wyższym procencie przeżycia, na przykład na poziomie 90%, zmniejszają ryzyko dodatkowych mutacji i nadal pozwalają na wystarczające wytworzenie mutantów auksotroficznych.
- Mutageneza UV i badania przesiewowe w kierunku auksotroficznych szczepów drożdży
- Przygotuj drożdże zgodnie z opisem w krokach 1.1.1-1.1.3.
- Wystawić drożdże na działanie dawki promieniowania UV odpowiadającej 50% przeżyciu, jak określono w ppkt 1.1.8. W przypadku WT S. boulardii dawkę tę określono na około 18 000 μJ (ryc. 2).
- Zebrać 1 ml objętości drożdży i osadów napromieniowanych promieniami UV przez odwirowanie w mikrowirówce przy 16 000 x g przez 1 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnej wody.
- Selekcja mutantów
- W przypadku selekcji, takiej jak w przypadku mutantów auksotroficznych ura3-, napromieniuj drożdże na płytce na pożywkę zawierającą kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA) w celu selekcji komórek pozbawionych funkcjonalnego enzymu Ura3.
UWAGA: Wszelkie drożdże zawierające funkcjonalne kopie Ura3 przekształcą 5-FOA w toksynę 5-fluorouracyl, prowadząc do śmierci komórki i umożliwiając łatwą selekcję ura3-kolonii, które nie mają funkcjonalnego Ura3. Analogiczne podejścia selekcyjne są możliwe dla LYS2 i LYS5; TRP1;oraz markery MET2 i MET15 przy użyciu pożywek zawierających kwas α-aminoadypinowy; kwas 5-fluoroantranilowy; i metylortęci.
- Odpipetować 100 μl zawieszonych komórek na minimalną ilość pożywki zawierającej 5-FOA i użyć sterylnego rozsiewacza, aby równomiernie pokryć płytkę. Owinąć płytki w Parafilm i inkubować do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni, aby umożliwić wzrost żywotnych kolonii drożdży.
- Potwierdź fenotyp ura3- dowolnej kolonii pojawiającej się na płytkach 5-FOA, ponownie nanosząc smugi na płytki YPD, uracylu i 5-FOA (ryc. 3). Użyj końcówki sterylnej wykałaczki, aby zebrać część pojedynczej kolonii i delikatnie przeciągnij komórki po świeżych płytkach YPD, uracylu i 5-FOA. Ponownie inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
UWAGA: Żywotne kolonie będą wyglądać jak wypukłe, mniej więcej okrągłe narośla, podczas gdy komórki niezdolne do życia pojawią się tylko jako nieprzezroczysty rozmaz bez żadnych wypukłych narośli (ryc. 3).
- Badania przesiewowe mutantów
- W przypadku wytwarzania mutanta auksotroficznego, dla którego metody selekcji nie są dostępne, należy przygotować seryjne rozcieńczenia komórek drożdży napromieniowanych promieniami UV w skali 1:10 w sterylnej wodzie i pipetować rozcieńczenia na pożywkę YPD, używając sterylnego rozsiewacza do równomiernego pokrycia płytki.
- Zawiń płytki w Parafilm i inkubuj do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni. Określ, które rozcieńczenie pozwoliło na wzrost poszczególnych kolonii, które można łatwo odróżnić od siebie, zwykle nie więcej niż około 100 kolonii na płytkę.
- Powtórzyć mutagenezę UV próbek drożdży, jak opisano w ppkt 1.2.1-1.2.3 i komórek płytki w tym oznaczonym rozcieńczeniu. Rozcieńczone drożdże należy pipetować na pożywce YPD, rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza i inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
- Badanie przesiewowe w kierunku auksotrofów poprzez replikowanie posiewu na selektywnych pożywkach pozbawionych metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania. Najpierw przymocuj sterylną aksamitną podkładkę do stojaka na talerze i odwróć płytkę z koloniami napromieniowanymi promieniowaniem UV na aksamit, zaznaczając orientację płytki.
- Następnie odwróć świeżą płytkę pozbawioną metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania na aksamit i lekko dociśnij, aby przenieść komórki z aksamitu na płytkę. Oryginalną płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Owinąć i inkubować nową płytkę do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
- Jako alternatywę dla posiewu replik, należy przeprowadzić badania przesiewowe mutantów poprzez ponowne rozpylenie kolonii z YPD na selektywne pożywki. Użyj końcówki sterylnej wykałaczki, aby zebrać część pojedynczej kolonii i delikatnie przeciągnij komórki po świeżej płytce YPD i płytce pozbawionej interesującego metabolitu. Ponownie inkubować owinięte płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-4 dni.
UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby wybrać pojedyncze kolonie i wielokrotnie rozszczepiać kolonie, aby potwierdzić jednorodną populację prawdziwych komórek auksotroficznych.
- Dalej potwierdzić fenotyp napromienianych komórek poprzez inokulację pojedynczych kolonii w 5-10 ml zarówno YPD, jak i pożywki pozbawionej odpowiedniego metabolitu (np. w pożywce uracylowej dla mutanta ura3-). Inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N w celu potwierdzenia wzrostu komórek w pożywce YPD, ale nie pod nieobecność metabolitu.
UWAGA: Chociaż wzorce wzrostu na pożywkach stałych powinny wyraźnie wskazywać na auksotroficzny status drożdży, możliwe jest, że niektóre drożdże tolerują stresy i tworzą małe, wolno rosnące kolonie na pożywkach stałych, ale nie tolerują tych samych warunków w pożywkach płynnych (obserwacje niepublikowane). Inokulacja do płynnych kultur powinna być zatem przeprowadzona w celu dokładnego potwierdzenia wzorców wzrostu mutantów napromieniowanych promieniowaniem UV.
- W celu długotrwałego przechowywania potwierdzonych mutantów auksotroficznych należy przygotować zapasy glicerolu poprzez zaszczepienie komórek w 10 ml YPD i inkubację na bębnie rolkowym O/N w temperaturze 30 °C. Komórki osadu należy oczyścić przez odwirowanie przez 3 minuty przy 2 500 x g i odessać pożywkę. Ponownie zawiesić komórki w 50% sterylnie przefiltrowanym glicerolu, przenieść do kriowialu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Drożdże mutagenne UV potencjalnie zawierają mutacje w wielu genach innych niż w markerze auksotroficznym, który jest przedmiotem zainteresowania. Przed kontynuowaniem stosowania zweryfikowanych mutantów auksotroficznych, szczepy te powinny być dalej analizowane poprzez sekwencjonowanie genów i ocenę odporności na pH, stres kwasów żółciowych i inne cechy istotne dla szczepów probiotycznych, jak opisano w innym miejscu2. Dodatkowo, jako alternatywę dla mutagenezy UV należy rozważyć zastosowanie homologii pcr lub celowania CRISPR/Cas9 w celu bardziej selektywnej mutacji markerów auksotroficznych.
2. Przemiana drożdży
- Przemiana LiOAc drożdży
- Inokulować pojedyncze kolonie drożdży w 5-10 ml pożywki YPD i inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30°C O/N.
- Aby indukować wzrost w fazie logarytmicznej i zwiększyć efektywność wychwytu plazmidu, należy określić stężenie komórek za pomocą spektrofotometru w celu zmierzenia rozcieńczenia komórek w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie w plastikowej kuwecie. Rozcieńczyć kultury O/N do gęstości optycznej 0,16-0,2 (około 2 x 10 6-2,5 x 106 komórek/ml) przy 600 nm (OD600) w 50 ml świeżej, ciepłej YPD i inkubować komórki na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na 200 obr./min, aż kultura osiągnie około 1 x 107 komórek/ml, zwykle około 4 godz.
UWAGA: Wydajność przemiany można zmierzyć jako funkcję liczby pomyślnie przekształconych jednostek tworzących kolonie drożdży (CFU) na μg plazmidowego DNA. Zwiększona wydajność skutkuje większą liczbą przekształconych kolonii na μg plazmidowego DNA. Hodowla komórek drożdży i zbieranie podczas wzrostu w fazie logarytmicznej jest jednym z czynników zwiększających wydajność transformacji.
- Granulki przez odwirowanie przy 2.500 x g przez 3 min.
- Odessać supernatant i przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, ponownie zawieszając osad w 1 ml sterylnej wody.
- Komórki osadu przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce, odessać supernatant i przepłukać komórki przez ponowne zawieszenie w 1 ml buforu TE/LiOAc (Tris EDTA/octan litu).
- Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić komórki w buforze TE/LiOAc do stężenia 2 x 109 komórek/ml.
- Przygotować mieszaniny transformacyjne z każdym z poniższych: 50 μl przygotowanych drożdży w buforze TE/LiOAc, 5 μl DNA nośnika (10 μg/μl) i 1 μl plazmidowego DNA (1 μg). Mikrogramy plazmidowego DNA mogą być miareczkowane, ponieważ rosnąca ilość DNA może, ale nie musi prowadzić do zwiększenia wydajności transformacji.
UWAGA: W przypadku zmutowanego szczepu drożdży pozbawionego jednego markera auksotroficznego, tylko jeden plazmid kodujący marker może zostać przekształcony w próbce. Co więcej, zastosowanie plazmidu kodującego łatwo wykrywalne białko, takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP), pozwoli na skuteczne określenie prawidłowego fałdowania i ekspresji białka heterologicznego przez szczep drożdży po transformacji.
- Do każdego preparatu dodać 300 μl PEG/LiOAc/TE i dokładnie wymieszać. Inkubacja nienaruszonych komórek za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) jest niezbędna do efektywnej transformacji.
- Inkubować preparaty w temperaturze 30 °C przez 30 minut z mieszaniem, umieszczając probówki do mikrowirówek w zlewce umieszczonej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min.
- Dodać 35 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej reakcji i ogrzewać komórki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Chociaż istnieją sprzeczne doniesienia o dodatkowych korzyściach płynących z DMSO, wykazano, że szok cieplny nienaruszonych komórek drożdży znacznie zwiększa wydajność transformacji.
- Przemyć komórki przez granulowanie przez odwirowanie, jak w ppkt 2.1.5, zasysanie lub pipetowanie supernatantu i ponowne zawieszenie w 1 ml sterylnej wody. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić osad komórek.
UWAGA: Bardzo ważne jest dokładne usunięcie supernatantu, ponieważ pożywki używane do generowania kompetentnych komórek mogą hamować wzrost drożdży i tworzenie kolonii.
- Powtórzyć granulowanie komórek, jak w ppkt 2.1.5, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnej wody. Odpipetować całą objętość na selektywną płytkę i za pomocą sterylnego rozsiewacza równomiernie pokryć płytkę przetworzonymi drożdżami.
- Owinąć brzegi powlekanych płytek w Parafilm, aby zapobiec wysuszeniu pożywki i inkubować do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2 dni, aby umożliwić wzrost przekształconych komórek drożdży. Udana, wydajna transformacja i auksotroficzna selekcja Saccharomyces cerevisiae daje dużą liczbę kolonii na preparat transformacyjny, chociaż wydajność może być znacznie niższa w przypadku innych szczepów (ryc. 4).
- Przechowywać płytki drożdży przez krótki okres (zwykle 1-3 tygodnie) do góry nogami i przykryć w temperaturze 4 °C. Przygotować zapasy glicerolu przetworzonych drożdży, jak opisano w ppkt 1.2.5, do długotrwałego przechowywania.
UWAGA: Konieczne są dalsze badania testujące transformowaną CFU w celu określenia stabilności plazmidu i oceny prawidłowej ekspresji białka heterologicznego. Dokładne opisy stabilności plazmidu, zastosowanie immunoblottingu do wykrywania zdenaturowanych białek odzyskanych z próbek komórkowych, test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania prawidłowo sfałdowanych białek trójwymiarowych oraz zastosowanie GFP w badaniach drożdży są dostępne gdzie indziej. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywny obraz udanej ekspresji GFP w transformowanych S. cerevisiaewzględem nieprzekształconych komórek. Zastosowanie takiego białka fluorescencyjnego jest jednym ze sposobów skutecznego określenia udanej produkcji białek heterologicznych.
- Elektroporacja drożdży
- Zaszczepić pojedyncze kolonie drożdży w 5-10 ml pożywki YPD i inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C O/N.
- Określ stężenie komórek za pomocą spektrofotometru, aby zmierzyć rozcieńczenie komórek w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie. Rozcieńczyć kultury O/N w 100 ml świeżej, ciepłej pożywki YPD do poziomu odpowiadającego OD600 wynoszącemu około 0,3. Inkubować subkultury w temperaturze 30 °C na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na 200 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 około 1,6, zwykle 4-5 godzin. Każda subkultura o objętości 100 ml wygeneruje wystarczającą ilość kondycjonowanych komórek do dwóch reakcji transformacji.
- Granulki przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 3 min. Odessać supernatant i przepłukać komórki przez ponowne zawieszenie w 50 ml lodowatej sterylnej wody. Powtórz pranie, granulując komórki, odsysając supernatant i ponownie zawieszając w świeżych 50 ml lodowatej sterylnej wody.
- Ponownie zagnieździć ogniwa i ponownie zawiesić w 50 ml lodowatego buforu do elektroporacji (1 M sorbitol, 1 mM chlorku wapnia (CaCl2)).
- Powtórzyć wirowanie jak w ppkt 2.2.3, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml 0,1 M LiOAc/10 mM ditiotreitolu (DTT). Zawiesinę komórek inkubować na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Preinkubacja komórek w LiOAc i DTT synergistycznie zwiększa wydajność elektroporacji.
- Rozpylić ogniwa jak w ppkt 2.2.3, usunąć supernatant i przemyć przez ponowne zawieszenie w 50 ml lodowatego buforu do elektroporacji. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze do elektroporacji do końcowej objętości 1 ml.
- Przygotuj na lodzie: kondycjonowane komórki drożdży, sterylne kuwety do elektroporacji i plazmidowe DNA. Natychmiast po ostatecznym ponownym zawieszeniu kondycjonowanych komórek w 1 ml buforu do elektroporacji, połącz 400 μl kondycjonowanych komórek drożdży z około 1 μg plazmidowego DNA i dodaj do lodowato zimnej kuwety do elektroporacji o wielkości 0,2 μm. Zastosowanie zwiększonych ilości DNA może nieznacznie zwiększyć wydajność transformacji. Inkubować reakcję na lodzie przez 5 minut, a następnie elektroporować elektroporatorem ustawionym na 2,5 kV i 25 μF.
UWAGA: Jak opisano w 2.1.7, zmutowany szczep drożdży pozbawiony jednego markera auksotroficznego może być przekształcony przy użyciu tylko jednego plazmidu kodującego zmutowany marker na próbkę. Ponadto użycie plazmidu, który koduje łatwo wykrywalne białko, takie jak GFP, pozwala na skuteczne określenie prawidłowego fałdowania i ekspresji heterologicznego białka po transformacji.
- Przenieść elektroporowane komórki do 8 ml mieszaniny sorbitolu YPD:1 M w stosunku 1:1 i pozostawić komórki do inkubacji na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C przez 60 minut.
- Osadzać ogniwa jak w ppkt 2.2.3 i ponownie zawiesić w 100 μl sorbitolu 1:1 YPD:1 M. Umieścić całą objętość na selektywnych pożywkach zawierających 1 M sorbitol, owinąć krawędzie płytek w parafilm i inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 2-5 dni, aby umożliwić wzrost przekształconych komórek drożdży.
UWAGA: Kluczowe znaczenie ma przetestowanie drożdży transformowanych w celu oceny prawidłowej ekspresji białka heterologicznego, jak opisano w 2.1.14 i 2.2.7.
- Zgłębnik jamy ustnej myszy z przekształconymi drożdżami
- Wykonywać wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i obchodzeniem się ze zwierzętami zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystaniem oraz zatwierdzeniem przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
- Przygotować kultury drożdży O/N poprzez inokulację pojedynczych kolonii przekształconych drożdży auksotroficznych w 5-10 ml selektywnych pożywek. Inkubować kultury O/N przez co najmniej 8 godzin na bębnie rolkowym w temperaturze 30 °C, aż do nasycenia.
UWAGA: Zastosowanie białek testowych kodujących plazmid, takich jak GFP, pozwoli na łatwe badanie ekspresji białek u drożdży gavaging, jak opisano w 4.7.
- W celu maksymalnej indukcji ekspresji białka i indukcji wzrostu w fazie logarytmicznej, należy przygotować subkultury z kultur O/N przez rozcieńczenie do równoważnika OD600 około 0,16-0,2 w 50 ml odpowiedniej pożywki, jak opisano w 2.1.2.
- Oznaczyć stężenie subkulturowanych komórek, jak w ppkt 1.1.2 i dostosować do 109 komórek/ml. Przygotować dawkę 100 μl dla każdej myszy, z kilkuset μl dodatkowej objętości na grupę, aby poprawić dokładność i łatwość ładowania próbki.
- Granulki należy rozdmuchiwać przez odwirowanie w ilości 2 500 x g przez 3 minuty lub w mikrowirówce przy stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając równą objętość sterylnej wody i delikatnie pipetując w górę iw dół.
- Przymocuj odpowiednią igłębkę do pomiaru (22 G dla myszy 15-20 g) na sterylnej strzykawce o pojemności 1 ml i załaduj próbkę drożdży, upewniając się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki i ustaw tłok na przyrost 100 μl. Załaduj dodatkową strzykawkę sterylną wodą, aby zgłębnikować myszy kontrolne i sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczających drożdży.
- Podnieś mysz, która ma być zgłębnikowana, używając ręki niedominującej, z palcem wskazującym i kciukiem mocno chwytającymi skórę wokół szyi (Rysunek 5A). Wsuń ogon pod mały palec, aby zapobiec ruchom dolnej części ciała. Upewnij się, że uchwyt jest bezpieczny i nie pozwala myszy poruszać głową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek wewnętrznych podczas gavlingu.
UWAGA: Oszacuj, jak daleko należy wprowadzić igłębkę, przytrzymując igłę przy myszy tak, aby bańka była równa z wyrostkiem mieczykowatym mostka. Włożenie tej długości igły zazwyczaj pozwoli gruszkowi igły do żołądka dostać się do żołądka.
- Używając dominującej ręki, delikatnie włóż igłębkę do przełyku myszy, ustawiając igłę pod kątem wzdłuż podniebienia i tylnej części gardła, trzymając się nieco na lewo od środka. Poczekaj, aż mysz połknie gruszkę igły i pozwól, aby igła opadła nieco dalej do punktu oszacowanego w ppkt 3.7 (Rysunek 5B). Jeśli podczas wbijania igły do zgłębnika odczuwany jest jakikolwiek opór lub jeśli mysz w dowolnym momencie zaczyna sapać, delikatnie wyjmij igłę i ponownie spróbuj znaleźć przełyk.
- Po połknięciu przez mysz gruszki igły do zgłębnika, delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby podać 100 μl (108 CFU) drożdży bezpośrednio do żołądka myszy.
UWAGA: Chociaż myszy nie są w stanie zwymiotować żadnego roztworu zgłębnika po podaniu, możliwe jest wystąpienie refluksu podczas zgłębnika. Prawidłowe wprowadzenie igły do zgłębnika, a także regulacja objętości i lepkości roztworu, może pomóc w ograniczeniu refluksu i zapewnieniu dokładnego dawkowania.
- Ostrożnie wyjmij igłębkę z żołądka i przełyku myszy i włóż mysz z powrotem do klatki. Sprawdź, czy mysz oddycha i porusza się normalnie po zgłębniku, aby upewnić się, że igła do zgłębnika została prawidłowo wprowadzona podczas całej procedury i że nie zassano żadnego roztworu.
Tabela 1. Lista odczynników. Opisano odczynniki potrzebne do przygotowania każdego z roztworów, pożywek i płytek drożdżowych oraz transformacyjnych używanych w protokołach w tym manuskrypcie.
| Rozwiązania | Pożywki i talerze drożdżowe | Odczynniki transformacyjne |
| Glikol polietylenowy (PEG) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 g peptonu | 50 ml 10x TE |
| 500 ml sterylnej wody | 20 g dekstrozy | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtr sterylizowany | 10 g ekstraktu drożdżowego | 400 ml sterylnej wody |
| 1 L wody | Filtr sterylizowany |
| autoklaw | |
| TE 10x: | Tabliczki YPD: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 mM Tris | 20 g peptonu | 400 ml 50% PEG |
| 10 mM EDTA | 20 g dekstrozy | 50 ml 10x TE |
| pH do 7,5 i sterylizacja filtra | 20 g agaru | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g ekstraktu drożdżowego | |
| 1 L wody | |
| autoklaw | |
| 20% glukozy: | Pożywki uracylowe | Nosicielska DNA (SS DNA): |
| 200 g dekstrozy | 2 g mieszanki aminokwasów bez uracylu | Przechowywać w temperaturze -20 °C, a przed użyciem podgrzewać przez 1-2 minuty w temperaturze 100 °C do stopienia pasm i przechowywać na lodzie |
| 1 L wody | 6,7 g drożdży azot zasada bez aminokwasów | |
| Filtr sterylizowany | 1 L wody | |
| Sterylizacja w autoklawie lub sterylne filtrowanie | |
| Dodaj 20% glukozy 1:10 przed użyciem | |
| 50% glicerolu: | Płytki uracylowe: | Bufor do elektroporacji: |
| 500 ml glicerolu | W kolbie o pojemności 250 ml: | 1 M sorbitol |
| 500 ml wody | 2 g mieszanki aminokwasów bez uracylu | 1 mM CaCl2 |
| autoklaw | 6,7 g drożdży azot zasada bez aminokwasów | Napełnij wodą destylowaną |
| 150 ml wody | Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C |
| W kolbie o pojemności 2 l: | |
| 20 g agaru | |
| 750 ml wody | |
| Kolby należy sterylizować w autoklawie oddzielnie, a następnie wymieszać ze 100 ml 20% glukozy | |
| Kompletny IMDM | 5 płyt FOA+: | LiOAc/naziemna telewizja cyfrowa |
| 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's firmy Iscove | Autoklaw w kolbie o pojemności 2 l: | 0,1 m LiOAc |
| 5 ml penicyliny streptomycyny glutaminy 100x | 20 g agaru | 10 mM naziemna telewizja cyfrowa |
| 500 μl 2-merkaptoetanolu | 750 ml wody | |
| 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca | mieszać: | |
| 2,5 ml pirogronianu sodu 100 mM | 6,7 g drożdży azot zasada bez aminokwasów | |
| 2 g mieszanki aminokwasów bez uracylu | |
| 150 ml ciepłej wody | |
| Gdy ostygnie, dodaj: | |
| 0,05 g uracylu w proszku | |
| 1 g 5-FOA | |
| Wymieszaj i przefiltruj, sterylizuj | |
| Dodać do autoklawowanego roztworu agaru | |
| Wymieszać ze 100 ml 20% glukozy | |
