Generowanie antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem

Streszczenie

Źródło: Pylaeva, E., et al. Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z nowotworem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje test do generowania antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem (TANs). Po pobraniu mysiego guza czerniaka zawierającego proangiogenne TAN, pojedyncze komórki są izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i traktowane inhibitorem fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT) w celu zmniejszenia zdolności do stymulowania angiogenezy.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

UWAGA: Ogólny schemat protokołu jest pokazany na rysunku 1.

1. Przygotowanie linii komórkowej czerniaka B16F10

1. Przygotować komórki mykoplazmoujemne wyhodowane do 90% zlewającej się monowarstwy (około 10 x 10⁶ komórek/kolbę T75) w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove (IMDMc: IMDM + 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1% penicylina-streptomycyna).
2. Usuń pożywkę i przepłucz komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Nałożyć 6 ml roztworu do oddzielania komórek zawierającego enzymy proteolityczne i kolagenolityczne (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
3. Delikatnie uderzyć w kolbę, aby zmobilizować pozostałe przylegające komórki od dołu. Zebrać zawiesinę komórek do probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Dodać 14 ml PBS i odwirować (300 x g i 20 °C przez 7 min).
5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
6. Policz komórki i ponownie je zawiesić do stężenia 3 x 10⁶/ml PBS (dla kroku 2) lub 6 x 10⁶/ml PBS (dla kroku 6) do wstrzykiwań. Trzymaj komórki na lodzie maksymalnie przez 30 minut.

2. Allogeniczny model guza u myszy

1. Użyj 10 samic myszy Ifnar1-/- w wieku 8-12 tygodni, które są trzymane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
   nuta: Samice myszy są preferowane w podskórnym modelu wzrostu guza, ponieważ samce są bardziej agresywne, a tym samym podatne na naruszenia miejsca guza, co wpływa na wzrost guza.
2. Ogol skórę myszy na boku golarką elektryczną i zdezynfekuj skórę chusteczką zwilżoną 70% etanolem.
3. Przygotować komórki czerniaka B16F10 o stężeniu 3 x 10⁶/ml PBS (patrz krok 1) zebrać w strzykawce o pojemności 1 ml i igle 0,4 x 19 mm. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl zawiesiny.
   1. Przed każdym wstrzyknięciem należy dobrze wymieszać komórki. Używaj igieł o średnicy nie mniejszej niż 0,4 mm, aby nie naruszać komórek nowotworowych.
4. Umieść do 5 myszy w jednej klatce i kontroluj wielkość guza (długość, szerokość i głębokość) za pomocą suwmiarki przez 14 dni.
   nuta: Zgodnie z przepisami dotyczącymi zwierząt, rozmiar guza nie powinien przekraczać 15 mm średnicy, myszy z większymi lub martwiczymi/otwartymi guzami powinny być wcześniej poświęcone.
5. W dniu 14 poświęć myszy w komorze CO₂
.
6. Zdezynfekuj skórę 70% etanolem i usuń guzy nożyczkami i kleszczami na sterylnej szalce Petriego. Trzymaj guzy w probówce o pojemności 50 ml w kompletnym zmodyfikowanym podłożu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna) na lodzie.

3. Izolacja TAN

1. Umieść guzy na sterylnych 6-dołkowych płytkach, po 5 guzów na dołek. Pokrój guzy na 2-3 mm kawałki sterylnymi nożyczkami.
   1. Trawić z 1 ml roztworu dispazy/kolagenazy D/DNazy I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg w 1 ml DMEMc) na guz. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze i mieszać ze strzykawką 10 ml bez igły co 15 minut 3 razy.
2. Aby usunąć niestrawione włókna, należy przesiać komórki przez filtry 100 μm w probówkach o pojemności 15 ml (jedna studzienka na filtr na probówkę). Dodać PBS do 15 ml, probówek odwirować o stężeniu 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
3. Lizować erytrocyty za pomocą buforu do lizy (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C), dodając 1 ml do każdej probówki. Dobrze wymieszaj i połącz roztwór ze wszystkich probówek w jedną. Zatrzymać reakcję po 2 minutach za pomocą 11 ml lodowatego (4 °C) DMEMc.
4. Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 15 ml zimnego PBS. Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
5. Zawiesić osad w 1 ml PBS. Dodać 3 μl przeciwciał przeciwko blokowi Fc (CD16/CD32, zapas 0,5 mg/ml) i inkubować na lodzie przez 15 minut.
6. Dodaj przeciwciała: 10 μl Ly6G-fikoerytryny (Ly6G-PE, zapas 0,2 mg/ml) i 10 μl CD11b-allofikocyjaniny (CD11b-APC, zapas 0,2 mg/ml). Dodać 20 μl barwnika żywotności 6-diamidyno-2-fenylindoldolu (DAPI, zapas 5 mg/ml) i inkubować na lodzie w ciemności przez 30 min.
   nuta: Można zastosować inną kombinację barwników żywotności i fluorescencyjnych koniugatów przeciwciał.
7. Dodać PBS do 15 ml, odwirować przy 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
8. Zawiesić osad w DMEMc do stężenia około 10 x^{10 6}/ml i trzymać na lodzie.
9. Sortuj żywe neutrofile CD11b⁺ Ly6G⁽DAPI-ujemne) za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (strategia bramkowania, patrz rysunek 2).
   nuta: Probówkę z zawiesiną komórek i probówkę z DMEMc dla posortowanych komórek należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować następujące optymalne ustawienia sortowania: dysza 70 μm, szybkość progowa maksymalna 22 000 zdarzeń/sekundę i natężenie przepływu 1-3.
10. Sprawdź czystość posortowanych neutrofili za pomocą cytometru, aby uzyskać zalecaną czystość >95%.
11. Odwirować posortowane neutrofile w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić posortowane komórki w DMEMc do stężenia 1 x 10⁶/mL.
    nuta: Oczekiwana liczba neutrofili w jednym 14-dniowym guzie B16F10 (o średnicy 10 mm) wynosi około 3 x 10⁴ komórek.

4. Hamowanie NAMPT w TANs in vitro

1. Przygotować zapas FK866 (inhibitor NAMPT) w dimetylosulfotlenku (DMSO) w końcowym stężeniu 100 mM.
2. Wysiewaj posortowane neutrofile (krok 3.11) do 2 dołków 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U (1,5 x 10⁵ neutrofili/dołek). Dodać FK866 do studzienki interwencyjnej (końcowe stężenie 100 nM) i taką samą ilość DMEMc z DMSO do studzienki kontrolnej. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.
3. Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić w 200 μl PBS w każdym dołku. Powtórz 2 razy.
4. Odwirować w temperaturze 460 x g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić w komercyjnej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka (uzupełnionej 4 μl/ml suplementu wzrostu komórek śródbłonka, 0,1 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 1 ng/ml rekombinowanego ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, heparyny 90 μg/ml i 1 μg/ml hydrokortyzonu) do końcowego stężenia 0,2 x 106 komórek/ml (w 0,75 ml) (dla kroku 5) lub w PBS do końcowego stężenia 0,6 x 10⁶ komórek/ml ( w 0,25 ml).

Wyniki

Rysunek 1. Schemat protokołu. Krok 1. Przygotowanie linii komórkowej czerniaka B16F10; 2. Allogeniczny model guza u myszy; 3. Izolacja TAN z guzów; 4. Hamowanie NAMPT w TANs in vitro; 5. Ocena właściwości angiogennych tan w teście pierścienia aortalnego; 6. Adoptywny transfer leczonych neutrofili w allogenicznym modelu guza; 7. Monitorowanie wzrostu guza, badanie histologiczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Niemcy	6,25,54,502
Probówki 50 ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy	227261
5ml / 10ml / 25ml sterylne końcówki do pipety automatycznej	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy	6006180 / 607180 / 760180
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z płaskim dnem	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Niemcy	8 33 920
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z płaskim dnem	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy	Numer katalogowy: 655180
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z dnem w kształcie litery U	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Niemcy	Numer katalogowy: 65018
anty-mysz CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	553312	klon M1/70, sprzężony z APC, 0,2 mg/ml
anty-mysz Ly6G	BioLegend, Kalifornia, Stany Zjednoczone	127608	klon 1A8, sprzężony z PE, 0,2 mg/ml
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone		Sortownik komórek
Zacisk	Vogel Niemcy, Kevelaer, Niemcy
Licznik komórek Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Niemcy
Sterylne filtry Cell Trics 50 μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Niemcy	04-004-2327 / 04-004-2328
Wirówka Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Niemcy	Numer katalogowy: 4706
Kolagenaza D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy	11088858001
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, mleczan)	BioLegend, Kalifornia, Stany Zjednoczone	422801	Zapas: 5 mg / ml
Rozkład I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy	D4818-2MG
DMEM (DMEM)	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 41966-029	DMEM kompletny: DMEM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna
DMSO (dimetylosufonsyd)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Niemcy	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNaza I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy	DN25-100MG
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 14190-094
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka	PromoCell, Heidelberg, Niemcy	Dokument C-22010
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Biochrom, Berlin, Niemcy	S0115
Blok FC (Ochrona przed myszą CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	553142	klon 2.4G2, Zapas: 0.5 mg / ml
Chlorowodorek FK 866	Axon Medchem, Groningen, Holandia	Axon 1546	Kolba: 100 mM
Kozia IgG Anty-Królicza H&L	Abcam, Cambridge, Wielka Brytania	ab97075	Cy3-sprzężony, Zapas: 0,5 mg/ml
Inkubator CO2 Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone	51026334
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	12440-053	Kompletny IMDM: IMDM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna
Golarka Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, Niemcy	90200714
Membrana podstawna Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Amsterdam, Holandia	7205011
Monoklonalna antyaktyna, α-mięśnie gładkie	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Niemcy	Zobacz materiał F3777	Sprzężony z FITC, brak informacji o koncentracji zapasów
Igły 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 302200
Neomount (Neomount	Merck, Darmstadt, Niemcy	HX67590916
Normalna surowica kozia	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Stany Zjednoczone	005-000-121
Penicylina Streptomycyna	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Rozdział 15140-122
Pipeta automatyczna Pipetus	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Niemcy	Numer katalogowy: 9907200
Mocowanie przeciwblaknięcia ProLong Gold z DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P36935
królik anty mysz Laminin gamma 1 łańcuch	Immundiagnostik, Bensheim, Niemcy	AP1001.1	Brak informacji o koncentracji zapasów
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A1105-01
Sterylny skalpel do utylizacji (nr 15)	MedWare, Neapol, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 120920
Strzykawki 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	303172
Strzykawki 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 309110
Sterylne kolby do hodowli komórkowych T75	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Niemcy	83,39,11,302

osób Klienta powiedział: powiedział: T )