Technika koniugacji awidyny i biotyny do prezentacji antygenów docelowych na Mycobacterium bovis BCG

Streszczenie

Źródło: Liao, T. A., et al., Ekspresja egzogennych antygenów w szczepionce BCG Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna. J. Vis. Exp. (2018).

Film demonstruje technikę ładowania antygenów na Mycobacterium bovis BCG w celu poprawy jego właściwości immunogennych. Metoda wykorzystuje system awidyna-biotyna do pokrycia powierzchni bakterii antygenami egzogennymi.

Protokół

1. Biotynylacja powierzchni komórek BCG

1. Hoduj BCG w bulionie Middlebrook 7H9 z 10% OADC (roztwór kwasu oleinowego, albuminy i dekstrozy) i 0,05% Tween 80 w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsającej przy 50 obr./min, aż OD = 0,5-1,
   UWAGA: BCG jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i wszystkie eksperymenty dotyczące BCG powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej.
2. Przemyj 10⁹ BCG 3 razy 500 μl lodowatego PBS wolnego od endotoksyn plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8,0). Zawiesić granulat BCG w sterylnym PBS wolnym od endotoksyn.
3. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj 1 ml 10 ml biotyny Sulfo-NHS SS w sterylnej przefiltrowanej wodzie.​
   1. Inkubować bakterie z 1 ml 0,5 mM biotyny Sulfo-NHS SS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Umyj oznakowane bakterie 3 razy 500 μl lodowatego zimnego PBST, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik biotynylacji.
   1. Ponownie zawiesić osad w 1 ml PBST.

2. Wiązanie monomerycznego białka fuzji awidyny z biotynylowaną powierzchnią BCG

1. Wymieszaj 5 x 10⁸ biotynylowanych BCG z białkiem Avi (10 μg/ml końcowy w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsarki.
2. Umyj bakterie 3 razy 500 μl mrożonego zimnego PBST.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bez endotoksyn RPMI 1640	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 36750
Biotyna Sulfo-NHS SS	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 21328
Rosół Middlebrook 7H9	Systemy diagnostyczne BD	Numer katalogowy: 271310
Organizacja OADC (Organizacja Zarządzania	Systemy diagnostyczne BD	Zobacz materiał B11886
Animacja 80	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1379

T powiedział: