Test do analizy testowego β-glukanu jako strategii immunoterapii przeciwko komórkom raka mózgu

Streszczenie

Źródło: Folgado-Dorado, C. et al., Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybowego jako strategia immunoterapii glejaka. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film demonstruje test in vitro wykorzystujący β-glukany do aktywacji komórek mikrogleju do produkcji rodników ponadtlenkowych, reaktywnych form tlenu. W komórkach raka mózgu generowane reaktywne utleniacze aktywnie hamują proliferację komórek nowotworowych i indukują śmierć komórki.

Protokół

Badanie in vitro stymulacji mikrogleju wywołanej β-glukanem

1. Hodowla komórkowa komórek glejaka myszy i komórek mikrogleju w 8-dołkowych szkiełkach komorowych

UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla linii komórkowych GL261 (glejak) i BV2 (mikroglej). Jednak z niewielkimi modyfikacjami kroki te mogą być potencjalnie wykorzystane do badania innych linii komórek nowotworowych i odpornościowych.

1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, kompletną pożywkę modyfikowaną L-glutaminą, 4,5 g/l D-glukozy i bez pirogronianu. Dodać 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Materiał należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
2. Zamrożone podwielokrotności BV2 i GL261 rozmrażać w łaźni wodnej (37 °C) przez 2 minuty, a tuż przed całkowitym rozmrożeniem przenieść je do okapu z przepływem laminarnym i umieścić komórki w dwóch różnych sterylnych kolbach T25 (po jednej dla każdej linii komórkowej).
3. Inkubować kolby T25 w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ aż do zlewania się kultury.
   nuta: W zależności od warunków zamarzania i czasu krioprezerwacji, czas do konfluencji może się różnić. Te linie komórkowe zwykle potrzebują od 3 do 5 dni, aby osiągnąć zbieg w kolbie T75.
4. Po tym, jak hodowla komórek BV2 stanie się zlewająca, przenieś ją do 8-dołkowych szkiełek komorowych 0,6 x 10⁶ komórek / dołek. Szkiełka z 8-dołkową komorą należy przechowywać w inkubatorze przez 24 godziny.
5. Po umieszczeniu komórek mikrogleju w 8-dołkowych szkiełkach komorowych powtórz ten sam protokół z komórkami GL261.

2. Aktywacja mikrogleju za pomocą β-glukanów

1. Pokryj komórki BV2 czterema różnymi β-glukanami (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus) w stężeniu 0,2 mg/ml przez 72 godziny. Jeden warunek doświadczalny musi pozostać nieleczony (normalna pożywka), działając jako grupa kontrolna.
2. Po 72 godzinach zebrać supernatant pipetą i przepuścić pozostałą objętość przez filtr strzykawkowy 0,20 μm. Następnie zawiesić supernatant w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny.

3. Leczenie GL261 wstępnie aktywowaną pożywką kondycjonowaną mikroglejem

1. Gdy GL261 zlewa się w 80% z szkiełkami w 8-dołkowych szkiełkach, dodaj pożywkę mikroglejową nasączoną β glukanem o końcowym stężeniu objętościowym 25% przez 72 godziny (całkowita objętość: 250 μl/dołek).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka 8-dołkowe komorowe	Thermo Fisher, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 171080
Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone	10564011
Extenda (α-amylaza/glukoamylaza)	Novozymes, Dania
Surowica bydlęca płodu	Gibco, Life Technologies, Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone	A4736301
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco, Life Technologies, Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 1010-015
Penicylina/streptomycyna	Sigma-Aldrich, St. Louis	Zobacz materiał P4458
inkubator	Powiat Eppedorf	Galaktyka 170S

powiedział: