$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja śledziony od myszy
- Przygotuj 1640 RPMI (Roswell Park Memorial institute): 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny.
- Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowe samce myszy C57bl/6 przez wdychanie CO2 . Spryskaj klatkę piersiową i boki myszy 70% etanolem. Po lewej stronie ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.
- Za pomocą małych kleszczy ostrożnie przesuń jelita i wątrobę na lewą stronę myszy i za pomocą cienkich nożyczek delikatnie wytnij śledzionę.
nuta: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ uszkodzenie przewodu pokarmowego może wywołać zanieczyszczenie.
- Umieść każdą wyciętą śledzionę w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki RPMI 1640.
2. Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych ze śledziony
UWAGA: Śledziona może zostać zdysocjowana do jednokomórkowej zawiesiny poprzez połączenie mechanicznej dysocjacji z trawieniem enzymatycznym.
- Przygotować roztwór do trawienia śledziony, dodając kolagenazę D (1 mg/ml; 0,29 j./mg liofilizowaną) i DNazę I (0,1 mg/ml) do przygotowanej pożywki RPMI 1640 (patrz krok 1.1)
- Za pomocą kleszczy przenieś śledzionę do rurki C (rurki dysocjacyjnej) zawierającej 3 ml roztworu do trawienia śledziony.
- Przeprowadzić dysocjację mechaniczną za pomocą półautomatycznego homogenizatora zgodnie z instrukcjami producenta.
- Umieść rurkę C na półautomatycznym homogenizatorze, upewniając się, że rurka C jest szczelnie umieszczona na obracającym się ramieniu. Po umieszczeniu rurki C naciśnij przycisk start na półautomatycznym homogenizatorze, aby uruchomić protokół Spleen 04.01 przez 60 s.
UWAGA: Dysocjację mechaniczną można również przeprowadzić, umieszczając filtr 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie przecierając śledzionę przez filtr. Po zmieleniu śledziony przepłukać filtr 40 μm 10 ml pożywki RPMI.
- Po dysocjacji mechanicznej należy odłączyć probówkę od homogenizatora i przeprowadzić trawienie enzymatyczne. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłej rotacji (20 obr./min).
- Przenieść roztwór, pipetując go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml po przefiltrowaniu przez sitko o średnicy 40 μm. Umyj sitko 40 μm 10 ml PBS (dPBS) firmy Dulbecco. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Po odwirowaniu całkowicie odessać supernatant i przepłukać osad poprzez ponowne zawieszenie go w 10 ml dPBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Izolacja CD11c+ DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony
- Zawiesić osad komórkowy w 5 ml dPBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.
- Granulować komórki, odwirowując w temperaturze 300 x g, przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl magnetycznie aktywowanego buforu do sortowania komórek (MAC).
- Dodać 100 μl mikrogranulek CD11c (patrz tabela materiałów) na 1 x 108 komórek.
- Zawiesinę komórkową należy zwirować i inkubować przez 10 minut w lodówce w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 10 ml buforu MACs, aby umyć komórki. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl buforu MAC.
4. Separacja magnetyczna DC11c+
UWAGA: Separacja magnetyczna odbywa się ręcznie za pomocą separatora magnetycznego (patrz Tabela materiałów) wyposażonego w kolumny LS. Separacja magnetyczna może być również wykonywana automatycznie za pomocą automatycznego separatora magnetycznego. (patrz Tabela materiałów).
- Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MAC i stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ.
- Przepłukać kolumnę LS 3 ml buforu.
- Umieścić zawiesinę komórek na każdej kolumnie LS i zebrać przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki.
- Umyj kolumnę LS 3 ml buforu MAC, zbierając nieznakowane komórki, które przez nią przechodzą. Umyj kolumnę LS jeszcze 2 razy.
- Wyjmij kolumnę LS z separatora magnetycznego. Dodaj 5 ml buforu MAC do każdej kolumny i natychmiast wypłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno zanurzając kolumnę LS w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
nuta: Ważne jest, aby wykonać podwójną izolację komórek CD11c w celu uzyskania zawiesiny komórek o wysokiej czystości. Dlatego powtórz kroki od 3.1 do 4.5. i odniesienie do rysunku 4 dla wzorców czystości. Ten etap poprawia czystość komórek CD11c+ do 90–95%.
- Określ liczbę DC CD11c+ na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. Rozcieńczyć próbkę komórkową w rozcieńczeniu 1:1 w 0,4% roztworze błękitu trypanowego.
UWAGA: Komórki niezdolne do życia zostaną zabarwione na niebiesko, podczas gdy żywe komórki pozostaną niewybarwione.
- Aby to zrobić, ostrożnie napełnij hemocytometr 10 μl rozcieńczenia próbki komórki i inkubuj przez 1 minutę.
- Policz komórki w 4 kwadratach o wymiarach 1 x 1 mm2 w komorze, która została załadowana, aby określić liczbę żywotnych komórek.
5. Obróbka in vitro o wysokiej zawartości soli CD11c+ DC
- Przygotować pożywkę hodowlaną DC, dodając 10% FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny do 500 ml 1640 RPMI.
- Przygotuj 10 pożywek do hodowli komórek o wysokiej zawartości soli (400 mM), ważąc 1,17 g NaCl i umieszczając go w sterylnej probówce sokoła o pojemności 50 ml. Dodać 50 ml sterylnej pożywki do hodowli komórek prądu stałego (przygotowanej w kroku 5.1) do probówki Falcona o pojemności 50 ml i wirować, aż NaCl znajdzie się w roztworze.
- Natychmiast przefiltruj pożywkę hodowlaną DC o wysokiej zawartości soli za pomocą filtracji próżniowej przez filtr 0,2 μm w okapie do hodowli komórkowych.
- Odwirować każdą zawiesinę komórkową ze śledziony przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4ºC. Zawiesić każdą osadkę komórkową w pożywce hodowlanej prądu stałego o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
- Odpipetować 900 μl (około 1 x 106 komórek) zawiesiny DC w 24-dołkowej płytce Falcon z płaskim dnem. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 mM. Oznaczyć płytkę i umieścić w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C na 48 godzin.
6. Adoptywne przeniesienie CD11c+ DC o wysokiej zawartości soli
- Po stymulacji in vitro przez 48 godzin wyjąć płytkę z inkubatora z humififikowanym CO2 w temperaturze 37 °C.
- Odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych w górę i w dół, aby ponownie zawiesić CD11c+ DC. Odpipetować całą zawiesinę CD11c+ DC do odpowiedniej oznaczonej probówki o pojemności 1,6 ml. Powtórz ten krok dla każdej studni z osobna.
- Odwirować każdą zawiesinę CD11c+ DC o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. Zawiesić osad DC w 100 μl sterylnego dPBS.
- Narysować zawiesinę DC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27 G 1/2 cala.
- Umieść naiwnego 10-tygodniowego samca myszy C57bl/6 pod 2% izofluranem, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania. Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadzić igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30°.
nuta: Skos igły 27 G powinien być skierowany w dół, z dala od oka, aby zapobiec uszkodzeniu oka.
- Powoli i płynnie wstrzykiwaj zawiesinę DC CD11c+ (około 1 x 106 ogniw). Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę z przestrzeni zadoczodołowej, mając na uwadze, aby nie uszkodzić oka.
nuta: Po wstrzyknięciu krwawienie powinno być niewielkie lub nie powinno być go wcale. Adoptywny transfer DC CD11c+ można również przeprowadzić przy użyciu metody iniekcji dożylnej (np. Żyła ogonowa). Myszy kontrolne otrzymały CD11c + DC, które były hodowane w normalnych pożywkach solnych.
- Usuń myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.