Obrazowanie transgenicznych komórek beta u myszy z niedoborem odporności i prowokacją ze splenocytami cukrzycowymi

Streszczenie

Źródło: Stewart, T. et al., Bioluminescencyjne monitorowanie przeżycia przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy.J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje metodę opartą na obrazowaniu, aby zwizualizować przeszczepione komórki beta z ekspresją lucyferazy do nieotyłej myszy z cukrzycą z niedoborem odporności. Wprowadzenie splenocytów od myszy z cukrzycą prowadzi do postępującego niszczenia komórek beta, co jest wizualnie potwierdzone spadkiem luminescencji po wprowadzeniu substratu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Inżynieria i utrzymanie linii komórkowych NIT-1

1. Utrzymuj linie komórkowe NIT-1, które dzielą tło genetyczne z nieotyłymi myszami z cukrzycą (NOD), oraz komórki 293FT w naczyniach poddanych hodowli tkankowej w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającej 4,5 g / l glukozy uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Zwiększ komórki 293FT do 70%-80% konfluencji w celu transfekcji.
3. Na 10 cm szalkę z komórek 293FT połączyć 10 μg blastu pLenti-lucyferazy (patrz plik uzupełniający 1), który ulega ekspresji transgenu lucyferazy świetlika (lucy2) pod kontrolą konstytutywnie aktywnego promotora EF1α, po 2 μg każdego z plazmidów pakujących pMD2.G, pMDLg/pRRE i pRSV-Rev, 4 μg plazmidu białka otoczki pCMV-VSV-G, i 60 μg liniowej polietyleniminy (PEI) w 1 ml DMEM bez surowicy. Dostosuj ilości w zależności od liczby komórek do transfekcji.
4. Pozostaw DNA, PEI i DMEM w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut, a następnie dodaj je do komórek 293FT.
5. Zebrać pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa 48 godzin po transfekcji.
6. Transdukuj komórki NIT-1 przy ~ 80% zbiegu za pomocą 1 ml pożywki zawierającej cząstki lentiwirusa na 10-6 komórek przez 48-72 godzin.
7. Wybierz komórki wykazujące ekspresję lucyferazy z 5 μg/ml blasticydyny przez 48 godzin.
8. Co więcej, zmodyfikuj genetycznie komórki wyrażające lucyferazę, aby dopasować je do pytania eksperymentalnego. Dla porównania dołącz linię komórek kontrolnych typu dzikiego lub nieukierunkowaną na ekspresję lucyferazy.
   nuta: Przykłady modyfikacji genów docelowych obejmują zgrupowany, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), nokaut, CRISPRa/i, knockdown shRNA i nadekspresję.

2. Przygotowanie komórek NIT-1 do przeszczepu

1. Hoduj komórki wyrażające lucyferazę, aż będą zlewać się w 80%-90%.
2. Usunąć pożywkę wzrostową i umyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 5 ml na 10 cm naczynie).
3. Dodaj 1 ml 0,05% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (trypsyna-EDTA) do każdego dania przez 2 minuty.
4. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml pożywki wzrostowej.
5. Za pomocą pipety zmyj komórki z naczynia i przenieś je do stożkowej probówki.
   nuta: Komórki z wielu szalek z tej samej linii komórkowej można łączyć.
6. Policz komórki za pomocą barwnika, takiego jak błękit trypanowy, ręcznie za pomocą hemocytometru lub automatycznie za pomocą automatycznego licznika komórek.
7. Odwirować przy 250 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą pipety zasysającej.
8. Zawiesić osad komórkowy w PBS w stężeniu 5 × 10⁷ komórek/ml (10-7 komórek na linię komórkową na mysz zostanie przeszczepionych w objętości 200 μl).
9. Trzymaj komórki na lodzie (do 3 godzin) do momentu przeszczepu.

3. Przeszczepienie komórek NIT-1 do nieotyłych myszy z cukrzycowym ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD-scid)

1. Znieczulić myszy biorcę (8-10-tygodniowe myszy NOD-scid tej samej płci co myszy używane do izolacji splenocytów) przez inhalację izofluranu w komorze knockdown. Dostarczyć 2,5% izofluranu do komory przy natężeniu przepływu 1,5 l/min i szybkości opróżniania 9 l/min.
2. Nasmaruj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Za pomocą golarki elektrycznej z osłoną usuń włosy z tyłu (grzbietowej strony) myszy, aby odsłonić skórę. Ogolony obszar przeszczepu będzie miał wymiary około 1 cal x 2 cale. Zwróć ogolone myszy do komory powalania do czasu przeszczepu.
4. Przenieś myszy pojedynczo na czystą powierzchnię za pomocą stożka nosowego z izofluranem. Delikatnie wprowadź głowę myszy w stożek nosowy. Użyj natężenia przepływu izofluranu 0,25 l/min, aby utrzymać znieczulenie podczas przeszczepu.
5. Przetrzyj obszar przeszczepu wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym, aby usunąć luźne włosy i zdezynfekować skórę.
6. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone przed załadowaniem strzykawki. Pobrać nadmiar objętości (>300 μl) komórek do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G. Usuń wszelkie bąbelki; następnie należy zwrócić nadmiar komórek do probówki, tak aby 300 μl zawiesiny komórek pozostało w strzykawce.
7. Używając pary zakrzywionych kleszczy trzymanych w niedominującej ręce, delikatnie unieś skórę po jednej stronie (lewej lub prawej) grzbietu myszy, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do przestrzeni podskórnej.
8. Używając ręki dominującej, ustaw strzykawkę równolegle do płaszczyzny czołowej i strzałkowej ciała myszy. Trzymając igłę skierowaną w stronę głowy myszy, wbij igłę w skórę w pobliżu kończyn tylnych i delikatnie wprowadź ją do przestrzeni podskórnej. Upewnij się, że cała igła pozostaje pod skórą i nie przebija się.
9. Wyreguluj kleszcze tak, aby delikatnie przytrzymywały skórę wokół podstawy igły. Powoli dozować niewielką ilość zawiesiny komórkowej (<50 μl) i upewnić się, że w miejscu wstrzyknięcia pod skórą tworzy się niewielkie wybrzuszenie. Kontynuować wstrzykiwanie zawiesiny komórkowej do momentu dostarczenia 200 μl do przestrzeni podskórnej.
10. Trzymając kleszcze na miejscu i trzymając igłę równolegle do ciała myszy, powoli wyjmij igłę. Po wyjęciu igły należy przytrzymać skórę zamkniętą kleszczami przez kilka sekund, aby zapobiec wyciekaniu komórek z rany kłutej.
11. Jeśli oceniana jest modyfikacja genetyczna, powtórz przeszczep po przeciwnej stronie myszy za pomocą innej strzykawki, tak aby zarówno komórki zmutowane, jak i kontrolne zostały wstrzyknięte do każdej myszy, z jedną linią komórkową po lewej, a drugą po prawej. Jeśli przeszczepiana jest tylko jedna linia komórkowa, wstrzyknij komórki tylko z jednej strony.
12. Po przeszczepie przenieś każdą mysz do nowej klatki. Pozwól każdej myszy w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu przed dodaniem kolejnych myszy do klatki.
    nuta: Myszy wracają do zdrowia, gdy wznawiają normalne czynności i nie wykazują oznak letargu ani upośledzonego ruchu.
13. Oceniaj stan zdrowia myszy codziennie przez cały czas trwania eksperymentu po przeszczepie. Jeśli przeszczepy tworzą duże wybrzuszenie lub myszy stają się słabe i ospałe, zmierz ich poziom glukozy we krwi i podaj 10% (w/w) wody sacharozowej ad libitum wszystkim myszom z hipoglikemią. Postępuj zgodnie ze wszystkimi zaleceniami weterynaryjnymi i poddaj eutanazji wszystkie myszy z utrzymującą się złą kondycją ciała zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W tym badaniu myszy zostały poddane eutanazji przez wdychanie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

4. Izolacja i oczyszczanie autoreaktywnych splenocytów

1. Zidentyfikuj 10-16-tygodniowe samce lub samice myszy NOD z niedawną (mniej niż 10 dni) cukrzycą, używając pasków testowych do pomiaru stężenia glukozy w moczu (lub krwi). Myszy NOD są uważane za cukrzyce, gdy mają poziom glukozy w moczu/krwi ≥250 mg/dl przez co najmniej 2 kolejne dni.
   nuta: Na każdą mysz NOD-scid potrzeba 10 milionów splenocytów; Jedna śledziona zwykle daje od 50 milionów do 150 milionów splenocytów. Splenocyty wyizolowano od myszy wolnych od patogenów trzymanych w ośrodku monitorowanym przez sentinal.
2. Poddaj eutanazji odpowiednią liczbę myszy z cukrzycą NOD.
   nuta: W tym badaniu myszy zostały poddane eutanazji przez wdychanie CO_{2 ,} a następnie zwichnięcie szyjki macicy w celu zapewnienia śmierci.
3. Trzymając mysz na plecach, wykonaj pionowe nacięcie skóry o długości około 2 cali nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz prawą stronę myszy z punktu widzenia badacza i zlokalizuj jaskrawoczerwoną śledzionę. Delikatnie odetnij śledzionę od różowej trzustki i przenieś ją na sterylną 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 5 ml sterylnego PBS. Powtórz sekcję z tyloma myszami, ile potrzeba.
   nuta: Śledziony od wielu myszy można połączyć w jednym naczyniu. Wykonaj następujące czynności przy użyciu sterylnych odczynników i sprzętu w sterylnym kapturze.
4. Rozgnieć śledzionę (śledziony) płaskim wierzchem sterylnego tłoka strzykawki.
5. Umieść sitko o pojemności 40 μm lub 70 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i umyj sitko 5 ml PBS, aby je zalać. Przenieść zawiesinę śledziony (śledziony) do sitka i kontynuować delikatne rozcieranie przez sitko. Umyj naczynie 10 ml PBS i przenieś płyn do sitka. Kontynuuj zacieranie, aż czerwony kolor zniknie z sitka.
6. Wyrzucić sitko i obracać probówkę o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety zasysającej.
7. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml (dla maksymalnie trzech śledzion) buforu do lizy ACK podgrzanego do temperatury rzeczywistej i poddać lizie czerwone krwinki przez 4 minuty. Zwiększyć objętość o 1-2 ml na śledzionę, jeśli potrzebne są dodatkowe śledziony.
8. Zatrzymaj reakcję za pomocą 5 ml pożywki komórkowej NIT-1 (opisanej powyżej) na 5 ml buforu do lizy. Przepuść zawiesinę komórkową przez świeże sitko, aby usunąć grudki. Wyrzuć sitko i wiruj z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml PBS i policzyć komórki. Wirować z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym PBS w stężeniu 1 × 10,⁸ komórek/ml (objętość wstrzyknięcia wynosi 0,1 ml/mysz) w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml z bezpieczną blokadą.
10. Przechowywać komórki na lodzie (nie dłużej niż 1 godzinę) lub utrzymywać komórki w temperaturze pokojowej i natychmiast przystąpić do iniekcji do żyły ogonowej.

5. Dożylne wstrzyknięcie splenocytów cukrzycowych przez żyłę ogonową boczną

1. Rozgrzej ciało dorosłego biorcy myszy NOD-scid (np. za pomocą lampy grzewczej przez ~5-10 min) w celu ukrwienia żył (pomaga to w wizualizacji i wstrzyknięciu do żyły).
   nuta: Aby uniknąć przegrzania myszy, nie przekraczaj tego czasu. Zawsze monitoruj stan zdrowia. Jeśli myszy wydają się wyczerpane lub nieruchome, natychmiast wyłącz lampę grzewczą.
2. Rozgrzej zawiesinę komórkową. Przygotuj sterylną strzykawkę (0,3-1,0 ml) ze sterylną igłą (27-30 g, 0,3 mm/0,5 cala lub mniejszą) lub użyj sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml z igłą 0,3 mm (0,5 cala). Igłę należy zawsze utrzymywać w sterylnym położeniu i używać sterylnej tacki, jeśli strzykawka musi być odłożona między wstrzyknięciami.
3. Roztwór splenocytu należy zawiesić przed każdym wstrzyknięciem. Dla każdej myszy pobrać do strzykawki 100 μl wstępnie podgrzanej i zmieszanej zawiesiny splenocytów. Upewnić się, że w strzykawce lub zawiesinie nie ma pęcherzyków powietrza.
   nuta: Upewnij się, że masz przygotowany cały sprzęt i materiały (chusteczki nasączone alkoholem do dezynfekcji, strzykawka wypełniona splenocytami do wstrzyknięcia oraz świeża klatka do oddzielania myszy, którym wstrzyknięto zastrzyk) przed umieszczeniem myszy w urządzeniu ograniczającym.
4. Umieść mysz w urządzeniu ograniczającym. Chwyć ogon ręką niedominującą i zlokalizuj jedną z dwóch bocznych żył ogonowych. W razie potrzeby delikatnie obróć ogon. Przetrzyj ogon chusteczką dezynfekującą (70% alkoholu izopropylowego), aby oczyścić skórę i zwiększyć widoczność żyły.
5. Wbij igłę pod ostrym kątem w centralną część ogona dominującą ręką. Ze skosem igły skierowanym do góry, wsuń igłę na kilka milimetrów przez skórę.
   nuta: Upewnij się, że igła jest równoległa do żyły i umieszczona nieznacznie pod skórą. Bądź przygotowany na nagłe ruchy myszy/ogona bezpośrednio po penetracji skóry/ściany naczynia. Udane wprowadzenie igły powinno być odczuwane jako "gładkie wsunięcie" do żyły. Jeśli potrzebna jest kolejna próba, przesuń się dalej w górę ogona w kierunku tułowia.
6. Delikatnie uciskać strzykawkę, aby wstrzyknąć zawiesinę splenocytów. Nie należy dopuścić do tego, aby igła przesuwała się dalej do środka lub na zewnątrz podczas wstrzykiwania. Udane wstrzyknięcia są gładkie, bez uczucia przeciwciśnienia podczas wstrzyknięcia i są sygnalizowane przezroczystym/białym przepływem krwi bezpośrednio po wstrzyknięciu.
7. Delikatnie wypuść igłę z żyły i lekko dociśnij ogon chusteczką dezynfekującą, aż krwawienie ustanie. Zwolnij mysz z urządzenia przytrzymującego i delikatnie przenieś ją do świeżo przygotowanej klatki.
   nuta: Wstrzyknij dwie do trzech myszy kontrolnych, które nie otrzymują przeszczepu komórek NIT-1 ze splenocytami, aby potwierdzić potencjał autoreaktywnych splenocytów do wywoływania cukrzycy, co trwa około 2-4 tygodni po wstrzyknięciu.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo przeszczepów NIT-1

UWAGA: Obrazuj przeszczepy raz do dwóch razy w tygodniu. W dniu przeszczepu należy odczekać co najmniej 2 godziny po przeszczepie, aby przeszczepy mogły się ustabilizować i zapewnić stabilną ekspresję lucyferazy. Jeśli czas jest czynnikiem ograniczającym, początkowy pomiar można wykonać w dniu 1. Zalecany początkowy schemat obrazowania to dzień 0 lub dzień 1 po wstrzyknięciu, dzień 5, dzień 10, dzień 14, dzień 18 i dzień 25. Dostosuj jednak harmonogram w oparciu o postęp autoimmunizacji oceniany na podstawie utraty sygnału bioluminescencyjnego.

1. Przygotować roztwór D-lucyferyny o stężeniu 15 mg/ml w PBS firmy Dulbecco. Mieszać w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia i sterylnie filtrować (0,22 μm). Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C i rozmrażać w razie potrzeby.
   nuta: Podwielokrotności można ponownie zamrozić.
2. Co najmniej 5 minut przed obrazowaniem należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 26 G roztwór D-lucyferyny w dawce 150 mg/kg.
   nuta: Do każdej myszy należy użyć świeżej strzykawki i igły.
3. Znieczulić myszy przez inhalację izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Zalecane warunki to 2,5% izofluran o natężeniu przepływu 1,5 l/min do komory wybijania i szybkości opróżniania 9 l/min.
4. Nasmaruj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu.
5. Otwórz oprogramowanie skojarzone z przyrządem do obrazowania. Utwórz nowego użytkownika i/lub zaloguj się. Na panelu sterowania w prawym dolnym rogu wybierz opcję Inicjuj (Rysunek 1A). Aby automatycznie zapisać dane obrazowania, utwórz odpowiednie foldery na komputerze, a następnie wybierz opcję Pobieranie | Automatyczne zapisywanie w... (Rysunek 1A). Po zakończeniu inicjalizacji przyrządu ustaw czas ekspozycji na 1 min.
   nuta: Pełne parametry obrazowania przedstawiono na rysunku 1B.
6. Przenoś myszy pojedynczo z komory knockdown do instrumentu do obrazowania. Połóż mysz na brzuchu z rozłożonymi kończynami i delikatnie wprowadź jej głowę do stożka nosa. Natężenie przepływu izofluranu wynoszące 0,25 l/min przez stożek nosowy jest odpowiednie do utrzymania znieczulenia podczas obrazowania. Delikatnie spłaszcz mysz, naciskając środek jej pleców obiema rękami, a następnie rozkładając dłonie na zewnątrz i rozsuwając je.
7. Wybierz opcję Pobierz (Rysunek 1B). Zapisz wszelkie istotne szczegóły eksperymentu w wyskakującym okienku (Rysunek 1C).
   nuta: Na rysunku 2A przedstawiono reprezentatywne obrazy trzech 8-tygodniowych samic myszy NOD-scid, którym przeszczepiono dwa przeszczepy w różnych punktach czasowych.

Wyniki

Rysunek 1: Zrzuty ekranu poleceń oprogramowania do obrazowania przeszczepów bioluminescencyjnych. (A) Przed przystąpieniem do obrazowania wybierz opcję Inicjalizuj, aby przygotować urządzenie. Obrazy mogą być auto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna, 0,53 mM EDTA	Corning	25-052-CI
293 stopy	Invitrogen	Czynnik R70007	Szybko rosnący, wysoce transfekwalny izolat klonalny pochodzący z ludzkich embrionalnych komórek nerkowych przekształconych za pomocą dużego antygenu T SV40
Bufor Lizy ACK	Gibco (firma Gibco)	A10492-01
Podkładki nasączone alkoholem, 70% alkoholu izopropylowego	Amazon/Zawsze gotowa pierwsza pomoc	B08NWF31DX
BD 5ml Końcówka strzykawki Luer-Lok	Bd	309646
Igła BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q	Bd	305115
BD 1 mL TB Końcówka strzykawkowa	Bd	309659
Blasticydyna S HCl	Corning	30-100-RB
Sitko do komórek premium SureStrain, 70 μm, sterylne	Południowe wyroby laboratoryjne	Zobacz materiał C4070	Lub użyj podobnego sterylnego sitka o wielkości porów 40-70um
Automatyczny licznik komórek CellDrop	Denovix powiedział:	Kropla komórkowa BF-PAYG	Lub użyj podobnego urządzenia do liczenia komórek
Corning 100 ml roztworu penicyliny i streptomycyny, 100x	Corning	30-002-CI
Pipety jednorazowe zasysające, polistyrenowe, sterylne, pojemność=2 ml	Firma VWR	Numer katalogowy: 414004-265	Lub użyj podobnej pipety zasysającej
D-lucyferyna, sól potasowa, klasa biologii molekularnej, proszek, >99%	Życiorys	SZCZĘŚCIE-100
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy	Gibco (firma Gibco)	10313039
Probówki Falcon BD, 50 ml	Fisher Naukowy	14-959-49A
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10437-028
Kleszcze premium do tkanek, 1 x 2 zęby 5 cali, niemiecka stal	Fisher Naukowy	13-820-074
Pasek testowy glukozy w moczu	Kalifornijska apteka dla zwierząt	U-TSG100	Lub użyj podobnego paska testowego do pomiarów glukozy w moczu / krwi
GlutaMAX–1 (100x)	Gibco (firma Gibco)	Numer telefonu 35050-061
Lampa grzewcza na podczerwień	Cole'a Parmera	Numer katalogowy: 03057-00	Lub użyj podobnej lampy na podczerwień
Strzykawka insulinowa 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 cala	Becton Dickinson	309306
Izofluran, USP	Intensywna terapia Piramal	6679401725
System obrazowania in vivo IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Instrument do nieinwazyjnego zbierania bioluminescencyjnych obrazów przeszczepionych komórek
Oprogramowanie do analizy obrazu na żywo	Perkin Elmer	128113	Oprogramowanie do zbierania i ilościowego określania sygnału bioluminescencyjnego
Probówki do mikrowirówek seal-rite, 1,5 ml	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1615-5510	Lub użyj podobnych sterylnych probówek do mikrowirówek
NIT-1	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2055	Linia beta-komórkowa trzustki pochodząca od myszy NOD / Lt
skinienie. Cg-Prkdcscid/J	Laboratorium Jacksona	1303	Myszy homozygotyczne pod względem ciężkiej złożonej spontanicznej mutacji niedoboru odporności Prkdcscid, powszechnie określanej jako scid, charakteryzują się brakiem funkcjonalnych limfocytów T i limfocytów B, limfopenią, hipogammaglobulinemią i normalnym mikrośrodowiskiem krwiotwórczym.
NOD/ShiLtJ	Laboratorium Jacksona	Rok 1976	Szczep myszy NOD/ShiLtJ (powszechnie nazywany NOD) jest poligenicznym modelem autoimmunologicznej cukrzycy typu 1
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher Naukowy	10010031	Bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej
pCMV-VSV-G	Addgene powiedział:	8454
pLenti-lucyferazy-blast	Wyprodukowano na miejscu	Plazmid dostępny na życzenie	Patrz plik uzupełniający 1
pMD2.G	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12259
pMDLg/pRRE	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12251
Polietylenin, liniowy, MW 25 000, stopień transfekcji (PEI 25K)	Fisher Naukowy	NC1014320
pRSV-Rev (wersja	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12253
Ogranicznik dla gryzoni, okrągły w stylu miotły 1 cal	Fisher Naukowy	01-288-32A
Nożyczki ostro zakończone	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 08-940	Lub użyj innych nożyczek wykonanych ze stali nierdzewnej klasy chirurgicznej
Naczynia hodowlane poddane działaniu kultur tkankowych	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	Lub użyj innych sterylnych szalek Petriego poddanych hodowli komórkowych
Pęsety/kleszcze, precyzyjne, ze średnią końcówką	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-000-157