Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Mac-Daniel, L., et al. Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenującego węzła chłonnego po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Materiały i odczynniki

1. Użyj samic komarów Anopheles stephensi (szczep Sda500), które żywią się zakażonymi myszami 3-5 dni po pojawieniu się i wychowują się zgodnie z wcześniejszym opisem.
2. Użyj pasożytów Plasmodium berghei ANKA klon eksprymujący gen zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą konstytutywnego promotora białka szoku cieplnego 70 (HSP70). Daje to jasną fluorescencję przez cały cykl życiowy pasożyta.
3. Użyj samic myszy C57BL/6JRj (7 tygodni).
   nuta: Wszystkie odczynniki użyte w opisanym protokole są wymienione w Table materiałów/Wyposażenia.

2. Izolacja sporozoitu z gruczołów ślinowych komarów

1. Między 18-25 dniem po zakaźnym posiłku z krwi należy zebrać i znieczulić je na zimno do 15 ml probówki na lodzie, jak opisano wcześniej. Ostrożnie przenieś je na szalkę Petriego, odwracając rurkę. Utrzymuj owady na lodzie i wystaw komary na 12-stopniową dawkę promieniowania γ lub x.
2. Wyizolować atenuowane sporozoity z napromieniowanych gruczołów ślinowych komarów, jak opisano wcześniej. Zbierz zainfekowane gruczoły ślinowe w małej objętości (około 15 μl) 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco na lodzie i delikatnie je zmiażdż, aby uwolnić sporozoity.
   nuta: Wstrzyknięcie wysoce skoncentrowanej zawiesiny pasożyta w małej objętości ma kluczowe znaczenie, dlatego konieczne jest pobranie wystarczającej liczby gruczołów ślinowych od dużej liczby wstępnie wyselekcjonowanych, dobrze zakażonych komarów, o czym świadczy ich silna ekspresja zielonej fluorescencji.
3. Przefiltruj zawiesinę sporozoitu przez nasadkę sitową o pojemności 35 μm dostosowaną do probówki mikrowirówkowej o niskiej przyczepności 1,5 ml w celu wyeliminowania grudek i resztek komarów.
4. Policz całkowitą liczbę wyizolowanych sporozoitów zgodnie z wcześniejszym opisem i dostosuj stężenie zawiesiny pasożyta zimnym 1x DPBS, aby uzyskać 83 000 sporozoitów/μl. Przechowuj pasożyty na lodzie, kontynuując kolejne kroki.
5. Pobrać równoważną liczbę gruczołów ślinowych od niezakażonych komarów, które zostaną wykorzystane jako kontrola ujemna, i przetworzyć próbkę zgodnie z opisem w krokach 2.2 i 2.3. Rozcieńczyć próbkę w sposób wskazany powyżej, aby uzyskać podobne stężenie ekstraktów z gruczołów ślinowych w zawiesinie.
   nuta: Sporozoity można przechowywać na lodzie maksymalnie 2 godziny. Jednak najlepiej byłoby je wstrzyknąć w ciągu godziny po zmiażdżeniu gruczołów ślinowych.

3. Wstrzykiwanie sporozoitów do warstwy skórnej ucha

1. Znieczulanie zwierząt przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Odczekaj 5-8 minut, aż mysz znajdzie się w stanie nieprzytomności i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Oceń głębokość znieczulenia, wykonując delikatne uszczypnięcie palców u obu tylnych stóp.
   nuta: Dawka znieczulenia trwa krócej niż 20 minut, dlatego kolejne kroki należy wykonać szybko.
2. Ustabilizuj małżowinę uszną myszy, mocując stronę brzuszną przezroczystą taśmą umieszczoną wcześniej pod mikroskopem stereoskopowym (ryc. 1A). Delikatnie dociśnij ucho, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego.
3. Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl/igłę ze skosem o rozmiarze 35 z 0,6 μl zawieszonych pasożytów.
4. Zawiesinę sporozoitu należy dostarczyć w 4 miejscach wstrzyknięcia (0,15 μl na miejsce), ostrożnie wprowadzając igłę po grzbietowej stronie ucha (ryc. 1A), pod naskórkiem, skosem do góry, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych. Pozostawić igłę w skórze właściwej przez kilka sekund, aby zapobiec cofaniu się iniekcji przed jej usunięciem. Pod koniec zabiegu należy obserwować charakterystyczny grudek w każdym miejscu wstrzyknięcia (ryc. 1B i 1C).
5. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie zdjąć ucho z taśmy.
6. Wstrzyknąć do ucha przeciwległego taką samą dawkę pasożytów, postępując zgodnie z krokami 3.2-3.4.
7. Wstrzyknij 2 dodatkowym myszom 0,6 μl 1x DPBS lub 0,6 μl 1x DPBS + ekstrakt z gruczołów ślinowych od niezakażonych komarów w celu oceny reakcji zapalnej, w której pośredniczy samo wstrzyknięcie i odkładanie się materiału komara w skórze właściwej.
8. Monitoruj powrót myszy do zdrowia po znieczuleniu przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce.
   nuta: Prawidłowe odkładanie się sporozoitu w skórze można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 2A i 2B), przy czym mysz przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem.

Wyniki

Rysunek 1: Iniehandlowe wstrzykiwanie sporozoitów do ucha myszy. (A) Obraz przedstawiający śródskórne wstrzyknięcie sporozoitów w małżowinę uszną znieczulonej myszy. Brzuszna strona ucha jest stabilizowana przezroczystą taśmą umieszczoną wcześniej pod mikroskopem preparacyjnym. Igłę ostrożnie wprowadza się po grzbietowej stronie ucha, pod naskórkiem, skosem do góry....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina: Imalgene® 1000	Merial	-	-
Ksylazyna: Rompun® 2%	Bayer	-	-
Strzykawka NanoFil + igła o rozmiarze 35	Światowe instrumenty precyzyjne	-	-
Omnican® 50 Strzykawka insulinowa 0,5 ml/50 I.U.	B. Braun Medyczny	9151125	-
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej MultiwellTM – płaskie dno	BD Sokół	353046	-
Sitko do komórek 70 μm	BD Sokół	Numer katalogowy: 352350	-
Strzykawka 2 ml	Terumo (Ziemia)	Zobacz materiał SS-02S	-
BLUE MAXTM 15ml Probówka stożkowa z polipropylenu	BD Sokół	352097	-
BLUE MAXTM 50ml Probówka stożkowa z polipropylenu	BD Sokół	352098	-
5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem z nasadką sitka 35 μm	BD Sokół	352235	-
DPBS 1X Cacl2 i MgCl2 wolne	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14190-094	-
DMEM 1X + GlutaMAXTM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 31966-021	-
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej typu IV	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5025	50 μg/ml
Samica myszy C57BL/6JRj (7-tygodniowa)	Laboratoria Janvier	-	-

od