1. Hodowla ludzkich iPSC (hiPSC) na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF)
UWAGA: Można również zastosować alternatywne metody hodowli hiPSC, w tym, ale nie ograniczając się do wysiewu na 6-dołkową płytkę wstępnie pokrytą żelatyną, galaretowatą mieszanką białek, rekombinowaną lamininą 511 lub jakąkolwiek inną macierzą zewnątrzkomórkową używaną do ekspansji hiPSC, i hodowaną przy użyciu zdefiniowanych pożywek specjalnie opracowanych dla hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Hodowla MEF
- Pokryć 10-centymetrową szalkę Petriego z hodowli komórkowej 4 ml 0,1% żelatyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Szybko rozmrozić fiolkę z 4 x 106 napromieniowanymi MEF w 10 ml pożywki MEF o temperaturze 37 °C (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1x penicylina-streptomycyna + 1x suplement L-glutaminy). Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki MEF.
- Wyjąć naczynie pokryte żelatyną z inkubatora. Odessać żelatynę i dodać 7 ml pożywki MEF. Umieścić 3 ml zawiesiny MEF (od kroku 1.1.2) na szalce pokrytej żelatyną. Kołysz naczyniem na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie MEF na naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8-36 godzin.
- Przejście hiPSC na MEF
UWAGA: Dane zostały wygenerowane przy użyciu antygenu czerniaka rozpoznawanego przez limfocyty T 1 (MART-1) iPSC pochodzącego z długotrwale hodowanych limfocytów naciekających nowotwór czerniaka (TIL), który specyficznie rozpoznaje peptyd MART-1 w kontekście ludzkiego antygenu leukocytów (HLA)-A*02:01.
- Przejście hiPSC, gdy kolonie mają średnicę od 0,8 do 1,2 mm. Przed pasażowaniem należy sprawdzić kolonie hiPSC w stereomikroskopie i usunąć wszelkie obszary różnicowania z kultury za pomocą plastikowej krawędzi końcówki o pojemności 200 μl.
- Odessać zużytą pożywkę i dodać 10 ml pożywki hiPSC (pożywka hodowlana ludzkich embrionalnych komórek macierzystych [ES] [tabela materiałów] + 10 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów [hbFGF]) uzupełnionych inhibitorem 10 μM kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK).
- Trzymaj naczynie do hodowli komórkowej w jednej ręce i przetocz jednorazowe narzędzie do pasowania komórek po całym naczyniu w jednym kierunku. Zastosuj wystarczający nacisk, aby całe ostrze rolki dotykało naczynia hodowlanego i utrzymywało równomierny nacisk podczas toczenia.
- Obrócić naczynie hodowlane pod kątem 90° i powtórzyć krok 1.2.3. Zobacz płytkę w mikroskopie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe cięcie kolonii, które powinny wyglądać na w kratkę. Odłączyć pocięte kolonie poprzez delikatne płukanie mechaniczne za pomocą pipety 200 μl.
nuta: Odrywanie pociętych kolonii przez mechaniczne spłukiwanie należy wykonać natychmiast po przecięciu kolonii wałkiem, ponieważ po 3 minutach wycięte kolonie zaczną ponownie przyczepiać się do szalki, a oderwanie kolonii o jednorodnej wielkości przez spłukiwanie stanie się trudne.
- Przenieść 350 - 600 kęp pociętych kolonii na nową 10 cm szalkę MEF (posiewaną 8 - 36 godzin przed pasażowaniem hiPSC) z 10 ml świeżej pożywki hiPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Inkubować w temperaturze 37 °C.
UWAGA: 600 grudek reprezentuje około 1,0 x 106 MART-1 iPSC i da 0,5-1,0 x 106 komórek DP w 35 dniu. Jednak oczekiwane liczby będą się różnić w zależności od siły wyjściowej linii komórkowej i warunków hodowli.
- Następnego dnia odessać zużytą pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hiPSC. Zmieniaj pożywkę hiPSC co 1-2 dni, w zależności od tempa wzrostu hiPSC.
2. Przygotowanie komórek OP9/DLL1 do kohodowli z hiPSC
- Hodowla komórek OP9/DLL1 w pożywce OP9 [α-minimum pożywka niezbędna (α-MEM) + 20% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1x penicylina-streptomycyna] w temperaturze 37 °C. Gdy komórki OP9 / DLL1 osiągną zbieg, odessać pożywkę i przemyć raz 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez magnezu, wapnia i fenolu.
- Odessać PBS i dodać 2 ml 0,05% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i mechanicznie zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o wielkości 100 μm, aby uniknąć zbrylania komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 12 ml pożywki OP9.
- Dodać 8 ml pożywki OP9 do sześciu nowych 10-centymetrowych szalek Petriego do hodowli komórkowych. Płytkę 2 ml zawiesiny komórek OP9/DLL1 z kroku 2.3 na każdą nową 10-centymetrową szalkę. Rozbujaj naczynie na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie OP9/DLL1 na talerzu.
- Inkubować w temperaturze 37 °C. Powtarzać pasaż co 2-3 dni, gdy komórki osiągną zlew.
nuta: Ważne jest, aby przygotować wystarczającą ilość zamrożonych ogniw OP9/DLL1 i rozmrażać nowy zapas co 4-6 tygodni.
3. Różnicowanie in vitro hiPSC w pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD8αβ+
- Przygotuj zżelatynizowane naczynia OP9/DLL1 na tydzień przed wspólną hodowlą z hiPSC. Aby przygotować 0,1% roztwór żelatyny, dodaj 5 ml podstawowego roztworu żelatyny o temperaturze pokojowej (RT) do 500 ml PBS.
- Pokryj 3 nowe 10-centymetrowe płytki Petriego z hodowlą komórkową, dodając 4 ml na szalkę 0,1% żelatyny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Odessać żelatynę i dodać 8 ml pożywki OP9 do każdej potrawy. Przełóż jedno zlejące się naczynie OP9/DLL1 (jak to zrobiono w sekcji 2 powyżej) do trzech wstępnie pokrytych żelatyną naczyń.
- Po 4 dniach dodaj 10 ml pożywki OP9 do każdej 10 cm pożywki OP9/DLL1 na żelatynie na 20 ml pożywki na miskę.
- Po 7 - 8 dniach rozpocznij kohodowlę hiPSC na zlewających się naczyniach OP9/DLL1 (dzień różnicowania 0).
- Odessać zużyte pożywki z konfluentnego 10-centymetrowego naczynia hiPSC na MEF. Dodać 10 ml pożywki OP9. Wyciąć i odłączyć kolonie hiPSC za pomocą jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek, jak to opisano w krokach 1.2.3 i 1.2.4.
- Przenieść 350 - 600 grudek pociętych kolonii na 10 cm wstępnie zżelowane naczynie OP9/DLL1 (krok 3.1) z 10 ml świeżej pożywki OP9 za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Rozbujaj naczynie hodowlane na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kolonii.
nuta: Alternatywnie można użyć wstępnie uformowanych ciał zarodkowych hiPSC (EB) lub zawiesiny o małych grudkach. Jednak preferowane jest użycie jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek lub systemu tworzenia EB w celu wytworzenia grudek hiPSC o jednolitej wielkości.
- W pierwszym dniu odessaj zużytą pożywkę i zastąp ją 20 ml świeżej pożywki OP9. Grudki hiPSC współhodowane na OP9 / DLL1 przez 1 dzień pojawią się jako małe okrągłe kolonie jednowarstwowe (ryc. 1).
- W 5 dniu odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. Kolonie hiPSC zaczną różnicować się w prymitywną mezodermę, charakteryzującą się wielowarstwowym ciemnym środkiem.
- W dniu 9 odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. W tym momencie wielowarstwowe struktury centralne wyewoluują w kształty przypominające kopułę, a obszar przypominający sieć peryferyjną stanie się widoczny
.
- W 13 dniu zbierz hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) (ryc. 1). Struktury pochodzące z hiPSC w dniu 13 charakteryzują się ciemnym centralnym organoidem otoczonym siecią obszarów przypominających kopułę, reprezentatywnych dla stref krwiotwórczych (HZ), o których wcześniej donoszono, że otaczają ludzkich embrionalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych krwi.
UWAGA: Obecność struktur przypominających kopułę wskazuje na udany proces nawet przy braku ciemnych centrów. Niezdolność do wytwarzania HPC może być spowodowana niską jakością OP9/DLL1, jakością partii FBS, zbiegiem grudek iPSC wysianych na OP9/DLL1 (optymalna jest 350-600 grudek) i/lub różnicami w potencji linii iPSC do produkcji prekursorów krwiotwórczych.
- Odessać zużyte podłoże i przemyć 1x 5 ml 1x fenolowego roztworu soli Hanksa bez czerwieni modyfikowanego wapniem i magnezem (HBSS).
- Odessać HBSS i dodać 250 μl 5000 jednostek/ml kolagenazy IV w 10 ml HBSS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Odessać HBSS kolagenazą dożylnie i przemyć raz 5 ml PBS.
- Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki OP9.
- Zawiesinę komórek płytki na nowej, zżelowanej, 10 cm szalce Petriego do hodowli komórkowej (patrz kroki 3.1.1 i 3.1.2). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie należy zebrać nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.
- Przenieść zawiesinę zebranych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej [pożywka OP9 z czynnikiem ludzkich komórek macierzystych 5 ng/ml (hSCF), 5 ng/ml ludzkiego liganda Flt3 (hFLT3L) i 5 ng/ml ludzkiej interleukiny 7 (hIL-7)].
- Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1.
- W dniu 16 przejdź przez komórki.
- Mechanicznie odłącz nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej.
- Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1.
- Kontynuuj pasażowanie nieprzylegających komórek co 5-7 dni, powtarzając krok 3.8.
- W 35 dniu wzbogać podwójnie dodatnią (DP) populację CD4 + CD8 + i stymulować do produkcji pojedynczych dodatnich (SP) limfocytów T CD8αβ + (SP) (Figura 2).
- Nieprzylegające komórki należy mechanicznie odłączać, delikatnie pipetując i filtrując przez sitko o wielkości 100 μm w celu usunięcia grudek. Wzbogać populację komórek CD4+ o izolację kulek magnetycznych CD4 zgodnie z protokołem producenta.
nuta: Uzasadnieniem stosowania kulek magnetycznych CD4 jest usunięcie komórek podwójnie ujemnych (DN) CD4-CD8 z hodowli, ponieważ wykazano, że powodują one bezpośrednie zabijanie komórek CD4 + CD8 + DP po stymulacji.
- Policz żywe komórki wzbogacone w CD4 za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego. Zawiesić w pożywce OP9 o całkowitym stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej (0,5 x 106 komórek) do każdej studzienki hodowli tkankowej o płaskim dnie, 24 zdrowe płytki zlewającej się OP9/DLL1.
- Dodać 100 j.m. ludzkiej interleukiny 2 (hIL-2), 5 ng/ml hIL-7, 500 ng/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i 2 μg/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD28, a następnie posiewać w temperaturze 37 °C.
