Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie potraw z komórek glejowych (2 tygodnie przed dniem hodowli)
- Wypreparuj korę mózgową z pourodzeniowego 1-dniowego mózgu myszy i oderwij opony mózgowe.
- Posiekaj tkankę kory mózgowej tak drobno, jak to możliwe, czystymi nożyczkami na czystej szalce Petriego na czystej ławce.
- Przenieś posiekaną tkankę do 12 ml HBSS i dodaj 1,5 ml 2,5% trypsyny i 1% (wag./obj.) DNazy. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut, huśtać się co 5 minut. Dobrze strawiona tkanka staje się lepka i tworzy duże skupisko. Rozcieraj 10-15 razy pipetą o pojemności 10 ml, aby rozbić tkankę i uzyskać lepsze trawienie.
- Dobrze strawioną tkankę należy rozcierać 10-15 razy pipetą o pojemności 5 ml, aż większość kawałków zniknie, a podłoże stanie się mętne. Przełóż przez sitko komórkowe, aby usunąć pozostałe kawałki i dodaj 15 ml pożywki glejowej (Minimalna pożywka niezbędna (MEM) uzupełniona glukozą (0,6% wag./obj.), 10% (obj./obj.) surowicą końską i penicyliną-streptomycyną (1x), aby zatrzymać trawienie.
- Odwirować komórki o sile 120 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy ze świeżą pożywką glejową i nasionami w szalkach do hodowli komórkowych (około 105 komórek/cm2 ).
- Zastąp pożywkę świeżą pożywką glejową następnego dnia, aby usunąć nieprzyłączone komórki.
- Podawaj naczynia z gleju co 3-4 dni świeżą pożywką glejową. Uderzyć kolbą 5-10 razy ręką, aby usunąć luźno przyczepione komórki przed zmianą podłoża.
- Po 10 dniach hodowli komórki glejowe powinny być prawie zlewające się. Odłącz komórki glejowe za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i wysiew około 105 komórek w nowym naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm. Pozostałe komórki można zamrozić do wykorzystania w przyszłości.
- Na 3 dni przed dniem hodowli zmień pożywkę glejową na pożywkę do hodowli neuronów (pożywka Neurobasal-A z 1x GlutaMAX-I i 1x suplementem B27)
2. Kultura neuronów hipokampa
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
- Wypreparuj 6-8 hipokampów od postnatalnych 1-dniowych szczeniąt myszy ANK3-E22/23f/f za pomocą pożywki HBSS na szalce Petriego w temperaturze pokojowej. Pokrój hipokampy nożyczkami preparacyjnymi na mniejsze kawałki. Przenieś hipokampy z szalki Petriego do probówki o pojemności 15 ml.
- Umyj hipokampy 2x 5 ml HBSS w probówce. Po umyciu pozostaw hipokampy w 4,5 ml 1x HBSS.
- Dodaj 0,5 ml 2,5% trypsyny do 4,5 ml HBSS i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Odwracaj rurkę co 5 minut. Dobrze strawione hipokampy powinny stać się lepkie i tworzyć skupisko. W razie potrzeby przedłuż trawienie o kolejne 5 minut.
- Umyj hipokampy HBSS 3 razy po 5 minut. Nie używaj odkurzacza do wyjmowania HBSS. Usunięcie hipokampa jest bardzo łatwe.
- Po umyciu dodaj 2 ml HBSS i odpipetuj hipokampy w górę i w dół pipetą Pasteura 15 razy.
- Rozetrzeć tkankę wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura (średnica otworu jest zwężona o połowę) 10 razy. Nie przekraczaj 10 razy, nawet jeśli pozostały jeszcze kawałki. Nadmierne ścinanie zabija neurony.
- Odstaw probówkę na 5 minut, aż wszystkie kawałki opadną na dno. Delikatnie użyj końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść supernatant zawierający zdysocjowane neurony do szalek posiałkowych (105 komórek/szalka 60 mm). Dodać go bezpośrednio do wstępnie inkubowanego podłoża galwanicznego i delikatnie potrząsnąć płytką.
- Powtarzaj kroki 2.6-2.7 z pozostałymi fragmentami, aż większość z nich zniknie.
- 2-4 godziny po wysianiu sprawdź naczynia galwaniczne pod mikroskopem świetlnym. Większość neuronów powinna była przyczepić się do szkiełka nakrywkowego. Dołączone komórki są okrągłe i jasne. Odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką do naczyń do karmienia komórek glejowych z wstępnie przygotowanym podłożem do hodowli neuronów, stroną z kropkami woskowymi skierowanymi w dół.
- Neurony mogą rosnąć w naczyniach zasilających komórki glejowe przez okres do 1 miesiąca. Karm neurony co 7 dni 1 ml świeżej pożywki do hodowli neuronów.
- Krok opcjonalny: 1 tydzień po wysiewie dodać arabinozyd cytozyny (1-β-D-arabinofuranozyzycytozynę) do końcowego stężenia 5 μM, aby zahamować proliferację gleju.
