Generowanie hodowli neuronów pierwotnych o niskiej gęstości z zamrożonych neuronów embrionalnych

Streszczenie

Źródło: Koganezawa, N. et al., Łatwa i odtwarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonych zasobów embrionalnych neuronów hipokampa.J. Vis. Exp. (2023)

Ten film demonstruje metodę hodowli kriokonserwowanych neuronów embrionalnych, obejmującą kontrolowane rozmrażanie, rozcieńczanie pożywką neurobazalną i wysiewanie na płytkę pokrytą poli-L-lizyną. Późniejsza inkubacja wspomaga wzrost i utrzymanie połączeń neuronalnych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Powłoka płyty

1. Pokryć 96-dołkową mikropłytkę poli-L-lizyną (1 mg/ml, rozcieńczony w 0,1 M buforze boranowym [pH: 8,5]; 100 μl/basenik) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   nuta: Pokryj tylko te studzienki, które mają być używane. W przeprowadzanych tu eksperymentach wykorzystuje się środkowe 60 studzienek. Bufor boranowy przygotowuje się przez zmieszanie 50 mM kwasu borowego i 12 mM boranu w wysterylizowanej wodzie.
2. Umyć płytkę dwukrotnie wysterylizowaną wodą (250 μl/studzienkę).
3. Umyć płytkę raz świeżą pożywką hodowlaną bez dodatków (250 μl/dołek).
4. Suszyć płytkę na czystej ławce przez 20 minut.
5. Owiń talerz folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia (ważny przez 1 miesiąc).

2. Sadzenie komórek

1. Dodać 50 μl/studzienkę pożywki hodowlanej do powlekanej płytki i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 30 minut do 1 godziny. Napełnić studzienki obwodowe wysterylizowaną wodą (200 μl/studzienkę).
   nuta: Pożywkę hodowlaną przygotowuje się przez dodanie 50x B-27, 400x Glutamax i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny do pożywki neuropodstawowej (szczegóły w Tabeli Materiałów).
2. Usuń kriowial neuronu ze zbiornika ciekłego azotu. Użyte tutaj neurony były neuronami kriokonserwowanymi dimetylosulfotlenkiem (DMSO-krioprezerwowanymi).
3. Zanurz kriowial w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C na maksymalnie 3 minuty i częściowo rozmrozić zawartość. Nie rozgrzewaj kriowialu zbyt długo. Przenieś zawartość do probówki o pojemności 50 ml zaraz po jej rozmrożeniu.
4. Powoli przenieś zawartość kriowialną neuronu do sterylnej probówki o pojemności 50 ml kroplami (50 μl/s) za pomocą pipety o pojemności 1 ml z końcówką o szerokich porach.
5. Przepłukać pusty kriowial 1 ml pożywki hodowlanej (temperatura pokojowa; RT). Przenieść ten 1 ml pożywki hodowlanej z kriowialnego kropli (50 μl/s) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórkową.
6. Dodać kroplami 9 ml pożywki hodowlanej (RT) do probówki o pojemności 50 ml (0,5 ml/s) i uzupełnić objętość do 11 ml. Nie powtarzać pipetowania, ale powoli mieszać zawiesinę komórek.
7. Policz liczbę komórek (użyj licznika komórek lub hemocytometru).
8. Przenieś całą zawiesinę komórek do zbiornika i dozuj zawiesinę komórek do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokich porach (1,0 x 10⁴ komórki/studzienkę). Aby zmniejszyć parowanie pożywki hodowlanej, napełnij studzienki obwodowe wysterylizowaną wodą (krok 2.1).
   nuta: Badanie to potwierdza, że parowanie pożywki hodowlanej jest małe jak na 3-tygodniową hodowlę bez wymiany pożywki. Szybkość redukcji pożywki wynosi 3,6% (n = 120 dołków). Dzięki temu zmiana osmolalności nie będzie drastyczna podczas 3-tygodniowego okresu inkubacji.
9. Inkubować neurony przez 1-2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
10. Zastąp pożywkę hodowlaną 100 μl podgrzanej pożywki (37 °C) na studzienkę i umieść ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ (podczas hodowli nie jest wymagana zmiana pożywki).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 96-dołkowa	Korporacja Zeon		utalentowany
Płytka 96-dołkowa	Greiner	655986
B-27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044	2 v/v% dla płyt MEA; 50x dla płyt normalnych
boraks	Sigma	B-9876	Stężenie końcowe 12 mM
Kwas borowy	WAKO	Numer katalogowy: 021-02195	Stężenie końcowe 50 mM
Albumina surowicy bydlęcej	Milipory	12659-100G	Stężenie końcowe: 3% w PBS
GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	Numer telefonu 35050-061	2,5 mM dla płyt MEA; 400x dla płyt normalnych
W analizatorze komórek 2200	Cytiva (Cytiwa)		Obrazy fluorescencyjne
Neuropodstawowy	Gibco (firma Gibco)	21103-049
Penicylina/Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	100 U/ml dla normalnych płytek
Penicylina/Streptomycyna	Nacalai Teskajska	26253-84	100 μg/ml dla płytek MEA
Poli-L-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P2636	Rozcieńczony w buforze boranowym (stężenie końcowe: 1 mg/ml)
Neuron NIEBA	AlzMed , Inc.	ARH001	1,0 x 106 ogniw/probówkę

powiedział: powiedział: