Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Powlekanie szkiełek nakrywkowych poli-L-lizyną
- Przygotować szkiełka nakrywkowe, rozmrażając 5 ml podwielokrotności 200 μg/ml roztworu poli-L-lizyny (PLL). Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy do 20 μg/ml dodając 45 ml czystej wody do wstrzykiwań. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Oznacz tę probówkę jako "PLL Sterile".
nuta: Użyj wody przechowywanej w temperaturze pokojowej, aby przyspieszyć proces rozmrażania.
- Do sterylnego roztworu PLL dodać 100 sterylnych, okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm. Mieszaj probówkę co 5–10 minut, przez 2–3 minuty, aby zapewnić równomierne pokrycie. Powlekaj szkiełka nakrywkowe w ten sposób przez 1 godz.
nuta: Preferowane są okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe produkcji niemieckiej (średnica = 12 mm), ponieważ zapewniają niezawodną powierzchnię hodowli i łatwo mieszczą się w studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
- Po 40 minutach powlekania PLL weź 2 kawałki bibuły i ułóż je płasko w komorze przepływowej. Wysterylizuj papier przy użyciu 70% etanolu, a następnie spłaszcz, aby usunąć zagniecenia i pozostaw do wyschnięcia.
- Po pokryciu szkiełek nakrywkowych przez 1 godzinę PLL, usuń nadmiar roztworu PLL i dodaj sterylną wodę do wstrzykiwań. Delikatnie mieszaj szkiełka nakrywkowe przez 2-3 sekundy, aby umożliwić usunięcie nadmiaru PLL. Powtórz ten etap płukania jeszcze 2 razy.
- Usuń nadmiar wody, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe na sterylną bibułkę. Ostrożnie oddziel każde szkiełko nakrywkowe za pomocą zakrzywionych kleszków i pozostaw do wyschnięcia.
nuta: Szkiełka nakrywkowe, które nie dają się łatwo rozdzielić, można wyrzucić. Alternatywnie można dodać niewielką ilość wody, aby ułatwić separację.
- Po wyschnięciu przenieś szkiełka nakrywkowe na 24-dołkową płytkę hodowlaną.
nuta: Szkiełka nakrywkowe należy przygotować około 30 min–1 godzinę przed rozpoczęciem procesu preparacji. Płytki można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy będą potrzebne.
2. Dysocjacja tkanki hipokampa i kory mózgowej
- Przygotowanie roztworów do hodowli komórkowych
- W celu dysocjacji tkanki nerwowej należy najpierw rozmrozić 40 ml podwielokrotności buforu do hodowli komórkowych (skład [w mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O i 25 D-glukozy, pH = 7,4). Odmierzyć 12 ml buforu do hodowli komórkowych do stożkowej probówki o pojemności 15 ml; etykieta jako "BSA". Odmierzyć 5 ml buforu do hodowli komórkowych do innej probówki o pojemności 15 ml; etykieta jako "papaina". Inkubować obie probówki w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
- Przefiltrować i wysterylizować pozostały bufor do hodowli komórkowych, oznaczyć jako "Bufor - sterylny" i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.
- Odważyć 120 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i dodać do probówki oznaczonej "BSA". Odważyć 7 mg papainy i dodać do probówki z napisem "papaina". Włóż obie rurki do łaźni wodnej na 15 min.
nuta: Pomocne jest dodanie niewielkiej ilości buforu do łodzi wagowej, aby ułatwić przenoszenie proszku papainy.
- Gdy wszystkie proszki się rozpuszczą, przesterylizuj każdy roztwór do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku papainy w probówce oznacz przefiltrowany roztwór jako "papaina - sterylna". W przypadku probówki BSA podzielić sterylny roztwór BSA na 3 probówki, z których każda zawiera 4 ml roztworu BSA. Oznacz każdą probówkę jako "BSA - Sterylne" i "1", "2" lub "3". Umieścić wszystkie probówki z powrotem w łaźni wodnej i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, aż będzie to wymagane.
- Przygotowanie do wypreparowania tkanek
- Wziąć pojedynczy kawałek bibuły filtracyjnej o średnicy 35 mm (patrz tabela materiałów) i wysterylizować 70% etanolem; pozostawić do wyschnięcia w pokrywie płytki Petriego o średnicy 100 mm w komorze przepływowej. Rozłóż nożyczki, kleszcze, skalpel i szpatułkę (patrz tabela materiałów) wymagane do wypreparowania hipokampa i kory.
- Umieść dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm i szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierające sterylną bibułę filtracyjną w łatwo dostępnym miejscu pośrodku komory przepływowej.
- Zbieraj transgeniczne NexCre; Szczenięta myszy Ai9 i VGAT Venus, które mają zostać wypreparowane. Użyć lampy fluorescencyjnej z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji (patrz Tabela materiałów), aby odróżnić świetlówki od rodzeństwa z miotu typu dzikiego.
- Bezpośrednio przed sekcją zwierząt należy wypełnić każdą szalkę Petriego o średnicy 35 mm schłodzonym, sterylnym buforem do hodowli komórkowych.
nuta: Jedna szalka Petriego służy do czyszczenia narzędzi między sekcjami, a druga do zbierania hipokampa i kory.
- Sekcja tkanek
- Jak tylko bufor do hodowli komórkowej zostanie wlany, odetnij głowę transgenicznemu szczeniakowi myszy lub szczura w dniu pourodzeniowym 0-2 za pomocą dużych, ostrych nożyczek i użyj sterylnej szalki Petriego o średnicy 100 mm, aby przenieść głowę do komory przepływowej. Użyj kleszczy, nożyczek i szpatułki, aby ostrożnie przenieść mózg transgenicznego szczeniaka na sterylną bibułę filtracyjną.
- Użyj skalpela typu 22, aby wyciąć móżdżek i oddzielić 2 półkule. Użyj małej szpatułki, aby przetoczyć półkule na boki. Na każdej półkuli delikatnie dociśnij, aby kora zetknęła się z bibułą filtracyjną. Delikatnie poruszaj obszarami śródmózgowia, aby odsłonić hipokamp i korę mózgową.
nuta: Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas naciskania na półkule, w przeciwnym razie komórki mogą zostać zmiażdżone.
- Użyj skalpela lub szpatułki, aby oddzielić hipokamp i korę od każdej półkuli. Przenieść wypreparowaną tkankę na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą schłodzony bufor do hodowli komórkowych.
nuta: W przypadku preparacji wielu zwierząt należy przechowywać sterylny bufor do hodowli komórkowych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Po każdym rozbiorze przenieś wypreparowaną tkankę do schłodzonego buforu do hodowli komórkowych.
- Po udanym wypreparowaniu tkanki korowo-hipokampowej przenieść sterylny roztwór papainy z łaźni wodnej do komory przepływowej. Użyj pipety Pasteura o pojemności 3 ml, aby przenieść wypreparowany hipokamp i korę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Siekaj na krzyż, używając płaskiej części skalpela typu 22, aż tkanka będzie na małe kawałki.
- Użyj niewielkiej ilości roztworu papainy, aby przenieść posiekaną tkankę z pokrywki szalki Petriego do sterylnej probówki z papainą. Umieścić probówkę z papainą z powrotem w łaźni wodnej i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 25 minut.
- Podczas inkubacji papainy należy przygotować kompletny roztwór pożywki fluorescencyjnej. Rozmrozić 1 ml porcji witaminy B27, 0,5 ml podwielokrotności Glutamax i 0,5 ml podwielokrotności Pen-Strep. Podajcie 48,5 ml pożywki hibernacyjnej A o niskiej fluorescencji do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Do roztworu dodać B27, Glutamax i Pen-Strep. Dobrze wstrząśnij roztworem, a następnie przefiltruj i wysterylizuj i oznacz jako "Hibernate A complete media" (z datą i inicjałami). Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
- Po inkubacji papainy przenieść probówkę papainy i sterylne probówki BSA do komory przepływowej. Użyj pipety Pasteura o pojemności 1 ml, aby usunąć tylko tkankę korowo-hipokampową z rurki papainy do probówki BSA 1,
nuta: Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować przenikanie nadmiaru roztworu papainy.
- Dysocjacja komórek
- Aby rozbić duże grudki tkanki, należy kilkakrotnie rozcierać tkankę za pomocą pipety Pasteura o pojemności 1 ml. Następnie rozcieraj tkankę 7 razy za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką. Pozostaw tkankę na 30 sekund, pozwalając większym kawałkom tkanki na osadzenie się.
- Po 30 s przenieść dolny 1 ml roztworu i tkankę z probówki BSA 1 do probówki BSA 2. Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA 2 za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.
- Po roztarciu ponownie przenieś dolny 1 ml tkanki i roztworu z probówki BSA 1, ale teraz do probówki BSA 3. Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA 3 za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.
- Po roztarciu przenieść cały roztwór i tkankę z probówek 2 i 3 do probówki BSA 1. Rozcierać jeszcze 2-3 razy i odwirowywać przy 3 000 x g przez 3 minuty.
- Podczas wirowania należy uzupełnić kompletne neuronalne podłoża podstawowe A (podłoże NBA). Podać 48,5 ml pożywki NBA do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Oznacz tę rurkę jako "Tylko NBA". Ponadto należy rozmrozić 1 ml podwielokrotności witaminy B27, 0,5 ml porcji Glutamax i 0,5 ml porcji Pen-Strep w temperaturze pokojowej.
- Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z granulowanej tkanki i ponownie zawiesić komórki w 2 ml kompletnej pożywki. Użyj pipety P1000, aby przetarć tkankę w górę i w dół 20 razy.
nuta: Należy uważać, aby nie pipetować komórek zbyt energicznie. Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, ogniwa mogą ulec uszkodzeniu.
- Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 1 ml przefiltrować zawiesinę komórek przez sito komórkowe o wielkości 30 μm do probówki z polistyrenu.
nuta: Jeżeli zawiesina komórek nie przejdzie natychmiast przez sito komórkowe, może być konieczne dociśnięcie wierzchu sita sterylną rękawicą, aby rozpocząć przepływ. Ten ważny krok zapobiega zatykaniu się sortownika komórek.
- Do pobierania neuronów po sortowaniu należy przygotować probówki pobierające, pipetując 300 μl kompletnej pożywki do wymaganej liczby probówek polipropylenowych.
- Zawiesina komórek jest teraz gotowa do zabrania do sortownika komórek w celu sortowania. Pobrać zawiesinę komórek, dodatkowe probówki zbiorcze i zapasowe kompletne podłoża na wypadek, gdyby wymagane było rozcieńczenie próbki.
3. Sortowanie komórek oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego
UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko skażenia bakteryjnego podczas sortowania, przepłucz rurkę próbki sortera 70% etanolem przez co najmniej 5 minut przed sortowaniem. Szczegółowe parametry sortowania różnią się w zależności od instrumentu, podstawowe kwestie są następujące.
- Podczas pierwszego sortowania komórek ustal poziomy fluorescencji tła z nieznakowanych komórek, sortując i porównując komórki od zwierzęcia typu dzikiego.
- Dla każdego typu ogniwa fluorescencyjnego, które ma być sortowane, należy dobrać odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji. Wzbudz białka Wenus i TdTomato za pomocą odpowiednio długości fal wzbudzenia 488 nm lub 531 nm. Wykrywanie emitowanego światła odpowiednio przez zestawy filtrów emisji 530/40 i 575/30.
- Dodaj polipropylenowe probówki zbiorcze, zawierające 300 μl kompletnej pożywki, do sortownika komórek w celu pobrania komórek.
- Aby uzyskać wysoką czystość, posortuj jaskrawo oznaczone komórki fluorescencyjne (patrz rysunek 1B, na przykład wykresy punktowe posortowanych komórek).
- Po sortowaniu, w celu uzyskania optymalnych wyników, należy przeprowadzić test czystości posortowanych komórek, aby oszacować poziom czystości. Należy pamiętać, że typowy wskaźnik odzysku komórek po sortowaniu wynosi od 70 do 80%.
- Zanotuj liczbę komórek posortowanych w każdej probówce zbiorczej. Ta wartość jest podawana przez przyrząd do sortowania komórek.
nuta: Sortowanie komórek można przeprowadzić za pomocą dyszy 70 μm (ciśnienie płynu w osłonie 70 psi) lub dyszy 100 μm (ciśnienie płynu w osłonie 20 psi).
4. Hodowla posortowanych neuronów
- Po posortowaniu komórek przenieś zebrane komórki do okrągłodennych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml za pomocą pipety Pasteura o pojemności 1 ml. Odwirować komórki o stężeniu 3 000 x g przez 3 minuty, aby uzyskać osad komórkowy.
nuta: Aby pomóc w określeniu położenia osadu komórkowego, należy ustawić probówki wirówkowe z okrągłym dnem tak, aby zawias pokrywy był skierowany na zewnątrz, co umożliwia utworzenie osadu komórkowego z tyłu probówki wirówkowej (tj. po tej samej stronie probówki co zawias).
- Podczas wirowania dodaj 1 ml witaminy B27, 0,5 ml Glutamax i 0,5 ml Pen-Strep do 48,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki NBA. Dobrze wstrząśnij roztworem, a następnie przefiltruj, wysterylizuj i oznacz jako "NBA complete media" (z datą i inicjałami). Wróć do łaźni wodnej, aż będzie to wymagane.
- Po odwirowaniu należy użyć pipety Pasteura o pojemności 1 ml, aby przenieść supernatant do innej probówki wirówkowej (zachować supernatant na wypadek, gdyby osad komórkowy został naruszony). Ponownie zawiesić granulki komórek w wymaganej ilości wstępnie podgrzanego, kompletnego podłoża NBA, aby osiągnąć gęstość komórek 1,000 komórek/μl. Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół za pomocą pipety P200 lub P1000.
- Aby potwierdzić obecność zdysocjowanych komórek, sprawdź roztwór komórek pod mikroskopem, używając soczewki obiektywowej 4x lub 10x. Alternatywnie, odpipetować niewielką ilość roztworu komórkowego na szkiełko nakrywkowe i sprawdzić pod mikroskopem. Jeśli obecna jest duża liczba komórek, supernatant z kroku 4.3 można odrzucić.
- Przed posiewem komórek należy wirować ze średnią prędkością przez 2-3 sekundy, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Po wirowaniu należy szybko odpipetować 10 μl zawiesiny komórek do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Po odpipetowaniu komórek szybko umieścić każdą płytkę z powrotem w inkubatorze (5% CO2/37 °C) i inkubować przez 1 h.
nuta: Jeśli dodajesz komórki do wielu płytek 24-dołkowych, zapewnij równomierne zagęszczenie komórek, wirując komórki między płytkami.
- Po 1 godzinie nakarmić komórki 500 μl wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki NBA i wrócić do inkubatora.
nuta: Podczas podawania komórek ważne jest, aby delikatnie pipetować pożywkę z boku studzienki, aby uniknąć oderwania się komórek. W przypadku krótkich eksperymentów (<16 dni) karmienie w powyższej gęstości nie jest konieczne. W przypadku posiewu o większej gęstości komórek może być wymagane częstsze karmienie.
