1. Przygotowanie mediów
UWAGA: Protokół opiera się na użyciu mieszanki dwóch oddzielnych pożywek: DMEM/F12 uzupełnionego zmodyfikowanym suplementem N2 i Neurobasal uzupełnionego suplementem B27, zazwyczaj w stosunku 1:1.
- Przygotować zmodyfikowany suplement N2, mieszając składniki w probówce o pojemności 15 ml. Nie wiruj tego ani nie filtruj; Mieszać, odwracając probówkę, aż roztwór będzie klarowny.
- Rozpocząć od odpipetowania 7,2 ml DMEM/F12, następnie dodać 1 ml insuliny o stężeniu 25 mg/ml (uzupełnionej w 0,01 M HCl) i dobrze wymieszać, odwracając probówkę. Mija kilka minut, zanim roztwór będzie klarowny.
- Dodać 1 ml 100 mg/ml apo-transferyny (sporządzonej w wodzie), 33 μl 0,6 mg/ml progesternonu (sporządzonej w etanolu), 100 μl 160 mg/ml (1 M) putrescyny (sporządzonej w wodzie), 10 μl 3 mM seleninu sodu (sporządzonej w wodzie) i 666 μl 7,5% albuminy surowicy bydlęcej i dobrze wymieszać probówkę. Porcję rozpuścić w 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
- Przygotuj nośnik.
- Do 250 ml DMEM/F12 dodać 2,5 ml N2. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.
- Do 250 ml pożywki Neurobasel dodać 5 ml suplementu B27. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.
- Wymieszaj podłoża z kroków 1.2.1 i 1.2.2 w stosunku 1:1. W niektórych przypadkach może być wymagana mieszanka 1:3 (uzupełniona jako mieszanka 1:1 w kroku 1.2.4).
- Do mieszanki dodać 0,5 ml L-glutaminy (stężenie końcowe 0,2 mM) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (stężenie końcowe 0,1 mM) i dobrze wymieszać bez wstrząsania. Przechowuj media w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni i unikaj wystawiania ich na działanie światła. Ta ostateczna mieszanka nazywa się N2B27.
- Przygotuj roztwór żelatyny.
- Przygotować 1% roztwór żelatyny w ultraczystej wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi, przez 15 minut. Ważne jest, aby używana do tego butelka była całkowicie czysta od detergentów lub środków dezynfekujących, dlatego zaleca się, aby używać do tego nowej butelki i płukać ją tylko w ultraczystej wodzie między użyciami. Podwielokrotność 1% roztworu rozdzielić na 50 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.
- Podwielokrotność 1% żelatyny należy podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do rozpuszczenia i dodać do 500 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dobrze wymieszaj i odpipetuj tyle, aby pokryć dno każdej studzienki lub płytki. Pozostaw żelatynę na powierzchni przez co najmniej 30 minut.
2. Powlekanie komórek
UWAGA: Ten protokół dotyczy w równym stopniu mysiego ESC hodowanego w 10% surowicy z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), zastępowania surowicy LIF lub pożywki bez surowicy z LIF i białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP4) lub inhibitorami MEK i GSK3 (pożywka 2i) z LIF lub bez. Jednak czas i skuteczność różnicowania mogą się różnić w zależności od pożywki i komórek. Do pokazanych tutaj eksperymentów użyliśmy mysiej linii ESC 46C (z reporterem EGFP wbitym w jeden z endogennych alleli Sox1), wyhodowanej w GMEM z 10% surowicą i LIF. Aby uzyskać optymalne wyniki, ważne jest, aby komórki zostały zdysocjowane i ponownie posiane w pożywce N2B27; zwykła zmiana pożywki z GMEM/surowicy/LIF na N2B27 zawsze skutkuje zmniejszoną wydajnością różnicowania w porównaniu z ponownym powlekaniem komórek.
- Hoduj komórki w GMEM z 10% surowicą, 1 mM pirogronianem sodu, 1x aminokwasami endogennymi, 0,1 M 2-merkaptoetanolem i 100 jednostkami/ml LIF13. Aby uzyskać subkonfluentną hodowlę mysiego ESC, umieść 1 x 106 komórek w kolbie hodowlanej T25, co zajmie 2-3 dni.
- Obserwuj komórki pod mikroskopem w jasnym polu. Gdy komórki są subkonfluentne i gotowe do przejścia, przepłucz je dwukrotnie w PBS. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek i ponownie umieścić w inkubatorze na 2 - 5 minut. Chociaż trypsyna i inne enzymy mogą być również używane do dysocjacji komórek, mogą negatywnie wpływać na przyczepianie komórek, więc trzeba będzie dostosować gęstość posiewu.
- Gdy komórki zaczną unosić się z płytki, postukaj w naczynie, aby przemieścić je do zawiesiny pojedynczej komórki. Zebrać komórki do 10 ml pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek, a następnie odpipetować do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Wiruj komórki w masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie ogrzanego N2B27, pipetując w górę i w dół 3 - 5 razy. Podczas pipetowania zawiesiny należy pipetować do boku probówki, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i zapisz stężenie.
- Przygotować zawiesinę komórek zawierającą żądaną liczbę komórek na jednostkę objętości, która ma być posiana na studzienkę we wstępnie ogrzanym N2B27. Optymalna jest gęstość 10 500 komórek nacm2 w naczyniu 6-dołkowym (tj. 1 x 105 komórek na dołek naczynia 6-dołkowego). W tabeli 1 przedstawiono sugerowaną liczbę komórek nacm2 oraz objętości pożywek galwanicznych dla różnych naczyń do hodowli komórkowych.
- Odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i umieścić zawiesinę komórek na płytce zgodnie z sugerowaną gęstością i objętością w tabeli 1. Nie obracaj płytek, ponieważ spowoduje to skoncentrowanie komórek do środka. Umieścić kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Zmieniaj pożywkę co 1-2 dni, wymieniając wszystkie nośniki na nowe N2B27. Pipetę należy delikatnie pipetować, ponieważ przepłukiwanie komórek może wpłynąć na gęstość i zmniejszyć efektywność różnicowania w ciągu następnych dni. Tam, gdzie początkowa żywotność po posiewie jest słaba, należy pokryć komórki mieszanką 1:3 pożywki uzupełnionej N2 i B27 i zmienić ją na N2B27 po pierwszych dwóch dniach. Komórki zaczną się różnicować i powinny wykazywać ekspresję Sox1 (widoczną przez zieloną fluorescencję reportera w zastosowanej tutaj linii komórkowej 46C) w ciągu 4 - 6 dni.
Tabela 1. Sugerowane gęstości poszycia i objętości mediów dla różnych rozmiarów naczyń. Gęstości posiewu w tej tabeli określono przy użyciu linii komórkowej 46C. W celu uzyskania optymalnych wyników może być konieczne dostosowanie gęstości powlekania każdej pojedynczej linii.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
| podest | Zakres gęstości efektywnej (komórki/cm2) | Zakres numeru komórki do tabliczki | Sugerowana początkowa objętość nośnika (μl) | Sugerowana objętość podłoża po 1 dniu (μl) |
| Płytka 6-dołkowa | od 10 500 do 36 500 | od 99 750 do 346 750 | 1 000 | 2 000 |
| Płytka 24-dołkowa | od 15 600 do 46 800 | od 29 640 do 88 920 | 500 | 1 000 |
| Płytka 96-dołkowa | od 103 500 do 260 000 | od 33 120 do 83 200 | 100 | 200 |