Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych w kulturach jednowarstwowych bez surowicy

Streszczenie

Źródło: Wongpaiboonwattana, W., et al. Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy. J. Vis. Exp.(2015)

Film demonstruje protokół, który wykorzystuje pożywki bez surowicy do generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pożądane stężenie embrionalnych komórek macierzystych, zawieszonych w podłożu niezawierającym surowicy, jest posiewane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych żelatyną. Przy optymalnym zagęszczeniu komórek komórki wytwarzają autokrynne czynniki sygnalizacyjne, które wraz z czynnikami indukującymi różnicowanie neuronalne w pożywce wolnej od surowicy wyzwalają różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w progenitory nerwowe.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Protokół opiera się na użyciu mieszanki dwóch oddzielnych pożywek: DMEM/F12 uzupełnionego zmodyfikowanym suplementem N2 i Neurobasal uzupełnionego suplementem B27, zazwyczaj w stosunku 1:1.

1. Przygotować zmodyfikowany suplement N2, mieszając składniki w probówce o pojemności 15 ml. Nie wiruj tego ani nie filtruj; Mieszać, odwracając probówkę, aż roztwór będzie klarowny.
   1. Rozpocząć od odpipetowania 7,2 ml DMEM/F12, następnie dodać 1 ml insuliny o stężeniu 25 mg/ml (uzupełnionej w 0,01 M HCl) i dobrze wymieszać, odwracając probówkę. Mija kilka minut, zanim r....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca płodu	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10270-106
DMEM/F12	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11320-074
Podłoże nerwowo-podstawowe	Technologie życiowe	21103-049
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek	Technologie życiowe	A11105-01
B-27 Suplement, bez surowicy	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17504-044
insulina	Sigma	I6634	Rozpuścić w sterylnym 0,01 M HCl
Apo-transferrin	Sigma	Zobacz materiał T1147	Rozpuścić w jałowej wodzie
progesteron	Sigma	Zobacz materiał P8783	Rozpuścić w etanolu
putrescyna	Sigma	Zobacz materiał P5780	Rozpuścić w jałowej wodzie
Selenin sodu	Sigma	Zobacz materiał S5261	Rozpuścić w jałowej wodzie
Frakcja V albuminy bydlęcej	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15260-037
L-glutamina	Technologie życiowe	25030-081	Upewnij się, że jest całkowicie rozpuszczona przed użyciem, ponieważ glutamina jest zwykle osadzona
żelatyna	Sigma	Klasa g1890
6-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych	Thermo Scientific	140675
24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych	Thermo Scientific	142475
96-dołkowe naczynie do hodowli tkankowej	Thermo Scientific	167008
GMEM (Przedsiębiorstwo GMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11710-035
Surowica bydlęca płodu	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10270-106
MEM Roztwór aminokwasów endogennych	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050
Pirogronian sodu	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11360-070
2-merkaptoetanol	Sigma	Zobacz materiał M7522
25cm2 kolba do hodowli tkankowych	Thermo Scientific	156367

powiedział: TGL