Różnicowanie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych w kulturę 3D za pomocą porowatego rusztowania

Streszczenie

Źródło: Stevanato, L. et al., Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych na trójwymiarowych hodowlach, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje rozwój i różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w trójwymiarowym rusztowaniu. Powłoka lamininowa na rusztowaniu sprzyja przyczepianiu się komórek, podczas gdy pożywka nerwowa wolna od czynnika wzrostu indukuje różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe, które rozszerzają swoje procesy w porowatej architekturze w wielu kierunkach, tworząc trójwymiarową kulturę

Protokół

1. Zróżnicowanie HNSC w kulturze trójwymiarowej (3D)

UWAGA: Wyizoluj i uzyskaj ludzkie nerwowe komórki macierzyste (hNSC) z etycznie zatwierdzonej tkanki opisanej w poprzedniej publikacji. Postępując zgodnie z tą procedurą, należy postępować zgodnie z wytycznymi etycznymi i instytucjonalnymi.

1. Hodowla 3D przy użyciu płytki 12-dołkowej
   1. Przez cały czas trwania procedury należy stosować technikę aseptyczną. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ponownie nawodnić rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę 70% etanolu przygotowanego przy użyciu wody do nawadniania (WFIr). Unikaj dotykania rusztowań, dozując 70% etanolu po ścianie każdej studni.
   2. Ostrożnie odessać 70% etanolu i natychmiast umyć rusztowania 2 ml/studzienkę Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) przez 1 minutę. Powtórzyć procedurę mycia dwukrotnie. Ostrożnie odessać DMEM: F12 po ostatnim praniu.
   3. Pokryj rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę lamininy (10 μg / ml) w DMEM: F12. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 przez} co najmniej 2 godziny. Umyj płytkę ciepłym DMEM: F12.
   4. Wysiewaj każde rusztowanie około 500 000 hNSC w objętości 150 μl czynników wzrostu RMM + (GF).
   5. Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 ,} aby umożliwić komórkom osadzenie się na rusztowaniach.
   6. Dodać 3,5 ml RMM do każdej studzienki, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań.
   7. Inkubować płytkę przez 7 dni; wymienić pożywkę RMM (3,5 ml/dołek) po 1 dniu (pierwsze karmienie) i ponownie po 2-3 dniach od pierwszego karmienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM:F12	Invitrogen	21331-020	Do przygotowania podłoża RMM
Roztwór albuminy ludzkiej	Baxter opieka zdrowotna ograniczona	1501052	Do pożywki RMM stosuje się w stężeniu końcowym 0,03%
Transferyna, rekombinowana przez człowieka	Sigma	Zobacz materiał T8158	W przypadku pożywki RMM stosuje się w stężeniu końcowym 5 μg/ml
Putrescyna DiHCl	Sigma	Zobacz materiał P5780	Dla pożywki RMM stosuje się w stężeniu końcowym 16,2 μg/ml
Insulina rekombinowana przez człowieka	Sigma	I9278	W przypadku pożywki RMM stosuje się w stężeniu końcowym 5 μg/ml
progesteron	Sigma	Zobacz materiał P6149	Dla pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu 60 ng/ml
L-glutamina	Invitrogen	25030-24	Do pożywki RMM stosuje się przy końcowym stężeniu 2 mM
Selenin sodu	Sigma	Zobacz materiał S9133	Dla pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu 40 ng/ml
bFGF (Fundusz Finansowy)	Peprotech	AF-100-15	Do dodania do pożywki RMM, stosowana w końcowym stężeniu 10 ng/ml
EFG (EFG	Peprotech	AF-100-188	Do dodania do pożywki RMM, stosować w końcowym stężeniu 20 ng/ml
4-OHT	Sigma	Zobacz materiał H7904	Do dodania do pożywki RMM, stosować w końcowym stężeniu 100 nM
Laminina	AMS Biotechnologia	Nr kat. 3400-010-10
Woda do nawadniania	Baxter Opieka zdrowotna	UKF7114
Płytka 12-dołkowa Alvetex	Reinnervate Sp. z o.o	AVP002
etanol	Merck	1.00986.1000