Generowanie zazwojowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Wu, H. F., et al. Efektywne różnicowanie pozazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę in vitro do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w komórki grzebienia nerwowego (NCC) na podporze macierzy błony podstawnej za pomocą pożywki różnicującej. NCC są następnie dysocjowane i formowane w sferoidy za pomocą innego ośrodka różnicującego. Wreszcie sferoidy są przekształcane w pozazwojowe neurony współczulne za pomocą współczulnego ośrodka neuronowego.

Protokół

1. Przygotowanie do powlekania potraw, przygotowania podłoża i konserwacji hPSC

1. Panierowanie naczyń
   1. Powłoka z witronektyną (VTN)
      1. Umieścić fiolki z VTN w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozmrożenia, a następnie dokładnie wymieszać.
      2. W przypadku szalki Petriego o średnicy 100 mm zmieszaj 7 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 0,5 mg/ml VTN, dodaj roztwór VTN do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
   2. Powłoka matrycy membrany podstawnej
      1. Rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej (patrz tabela materiałów) na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. W przypadku jednego dołka na 6-dołkowej płytce wymieszaj 2 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco z 20 μl 100-krotnej matrycy błony podstawnej, dodaj roztwór matrycy błony podstawnej do naczynia, owiń naczynie folią parafinową i przechowuj w czystym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc. Pracuj tak szybko, jak to możliwe. Naczynia powlekane można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
   3. Powłoka z poliornityny (PO)/lamininy (LM)/fibronektyny (FN)
      1. Pierwszego dnia, w przypadku jednego dołka z 24-dołkowej płytki, zmieszać 15 μg/ml PO z 1 ml 1x PBS, inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc. Rozmrozić zarówno LM, jak i FN w temperaturze -20 °C przez noc i przechowywać w temperaturze 4 °C aż do całkowitego rozmrożenia.
      2. Drugiego dnia odessać roztwór PO, przemyć studzienki 2x 1x PBS, dodać 1 ml 1x PBS zawierającego 2 μg/ml LM i 2 μg/ml FN i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc. W tym momencie naczynie z roztworem LM/FN można przechowywać w inkubatorze przez wiele miesięcy, o ile nie wyschnie. Dodaj więcej 1x PBS, aby zapobiec wysychaniu naczynia.
2. Przygotowanie podłoża
   1. Przygotuj pożywkę Essential 8 (E8), rozmrażając jedną butelkę suplementu E8 w temperaturze 4 °C przez noc. Wymieszaj suplement z 500 ml pożywki E8 i antybiotykami, jeśli to konieczne.
      nuta: Roztwór roboczy E8 należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
   2. Przygotować pożywkę do zamrażania hPSC, mieszając 90 ml kompletnej pożywki E8 z 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do całkowitej objętości 100 ml. Filtruj sterylizację.
   3. Przygotuj pożywkę różnicującą dzień 0 do dnia 1, mieszając 100 ml pożywki essential 6 (E6) z 10 μM SB431542, 1 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 i 10 μM Y27632, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml.
   4. Przygotować pożywkę różnicującą dnia 2 do dnia 10, mieszając 100 ml pożywki E6 z 10 μM SB i 0,75 μM CHIR99021 uzyskać całkowitą objętość 100 ml.
   5. Przygotuj pożywkę sferoidalną z dnia 10 do dnia 14, mieszając pożywkę neuropodstawową z 2 ml witaminy B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutaminianu, 3 μM CHIR99021 i 10 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF2) na łączną objętość 100 ml.
   6. Przygotuj pożywkę od dnia 14 do dnia 28 do długotrwałego utrzymania sferoidy, dodając 0,5 μM świeżego kwasu retinowego (RA) do pożywki sferoidalnej od dnia 10 do dnia 14 przy każdym karmieniu.
      nuta: RS należy zawsze utrzymywać w temperaturze -80 °C.
   7. Przygotować pożywkę do dojrzewania SymN, mieszając pożywkę neuropodstawową z 2 ml witaminy B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutaminianu, 25 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), 25 ng / ml neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF), 25 ng / ml czynnika wzrostu nerwów (NGF), 200 μM kwasu askorbinowego i 0,2 mM cyklicznego monofosforanu adenozyny dibutyrylu (dbcAMP) do całkowitej objętości 100 ml. Roztwór należy zużyć w ciągu 2 tygodni. Przed każdym karmieniem dodaj 0,125 μM świeżego RA. Roztwór ten stosuje się od 14 dnia (opcja 1) lub 28 dnia (opcja 2).
   8. Przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), mieszając DMEM z 2% FBS, 2 mM L-glutaminianu i antybiotykami, jeśli to konieczne, do całkowitej objętości 100 ml.
3. Utrzymanie hPSC
   1. Rozmrażanie i przechowywanie hPSC
      1. Przygotuj jedno naczynie z powłoką VTN o średnicy 100 mm.
      2. Aby rozmrozić fiolkę z hPSC bezpośrednio z ciekłego azotu, należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ostrożnie obracając probówkę w wodzie, aż do rozmrożenia. Przenieść rozmrożone hPSC do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 1x PBS i odwirować przy 200 x g przez 4 min.
      3. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml pożywki E8 do probówki. Odpipetować kilka razy, aby całkowicie zawiesić osad, a następnie dodać kolejne 9 ml pożywki E8, aby uzyskać łącznie 10 ml.
      4. Odessać roztwór VTN z szalki o średnicy 100 mm.
      5. Przenieś hPSC do naczynia o średnicy 100 mm, delikatnie potrząśnij (góra-dół i lewo-prawo, nie w kółko), aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w naczyniu
      6. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .
      7. Następnego dnia odessać całe podłoże i podawać 10 ml E8.
      8. Karm w ten sposób codziennie przez następne 3-4 dni, a następnie przygotuj się do podziału.
   2. Podział hPSCs
      UWAGA: hPSC w momencie podziału powinny być w 80%–90% zlewne. Należy obserwować duże kolonie o gładkich i jasnych krawędziach. Należy jednak unikać kontaktu między każdą kolonią (ryc. 1B, dzień 0 i ryc. 4B).
      1. W razie potrzeby przygotuj naczynia 100 mm powlekane VTN.
      2. Zassać E8 i umyć naczynie, które ma zostać podzielone 1x za pomocą 1x PBS.
      3. Odessać 1x PBS i dodać 4 ml 0,25 M EDTA. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
         nuta: Komórki hPSC powinny być dzielone/ponownie powlekane jako małe kolonie. Nie należy leczyć kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec rozdzieleniu na pojedyncze komórki. Komórki powinny być nadal przymocowane do powierzchni naczynia po 2-minutowym zabiegu.
      4. Odessać EDTA, odłączyć kolonie przez silne pipetowanie 10 ml pożywki E8 na powierzchnię naczynia i zebrać całą pożywkę i komórki w probówce o pojemności 15 ml.
      5. Przy zbieżności hPSC na poziomie 80%–90% podziel kolonie na 1:15-1:20. Na przykład, aby rozdzielić hPSC w stosunku 1:20 na jedno naczynie o średnicy 100 mm, weź 500 μl roztworu E8/hPSC i wymieszaj z 9,5 ml świeżej pożywki E8.
      6. Płytki hPSC w szalkach 100 mm z powłoką VTN.
         nuta: Zaleca się ustalenie idealnego stosunku podziału dla każdego badacza i linii komórkowej niezależnie.
   3. Zamrażanie komórek komórek zakaźnych
      1. Na jedną 100-milimetrową szalkę hPSC, która jest gotowa do podziału, przygotuj trzy kriowiale i 3,5 ml pożywki do zamrażania.
         UWAGA: Pożywki i fiolki należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia.
      2. Odessać E8 i umyć naczynie 2x za pomocą 1x PBS.
      3. Odessać 1x PBS i dodać 4 ml 0,25 M EDTA, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂,
         UWAGA: hPSC powinny być zamrożone jako małe kolonie w czasie, gdy miałyby zostać podzielone. Nie należy traktować komórek EDTA dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec rozdzieleniu na pojedyncze komórki. Po 2 minutowym zabiegu komórki powinny być nadal przyczepione do powierzchni naczynia.
      4. Odessać EDTA, odłączyć kolonie przez silne pipetowanie 10 ml 1x PBS na powierzchni naczynia i zebrać całą pożywkę i komórki w probówce o pojemności 50 ml.
      5. Dodaj 20 ml 1x PBS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty, aby wypłukać pozostały EDTA.
      6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki zamrażającej.
      7. Rozprowadzić hPSC równomiernie w trzech kriowiałach po 1 ml każdy.
      8. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc w kontrolowanym zamrażalniku lub styropianowej kanapce, aby zapewnić powolny spadek temperatury, a następnie przenieść do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

2. Wysiewanie hPSC w celu rozpoczęcia różnicowania (dzień 0)

UWAGA: hPSC powinny być gotowe do różnicowania po ustabilizowaniu (tj. rozszczepieniu 2-3x po rozmrożeniu). Upewnij się, że kolonie są zdrowe, z gładkimi, błyszczącymi krawędziami i minimalnym zróżnicowaniem (ryc. 2B).

1. W razie potrzeby przygotuj naczynia pokryte matrycą z membraną podstawną (24 dołki lub 6 dołków) dzień przed dniem 0. Przynieś naczynia do RT na początku różnicowania.
2. W razie potrzeby przygotuj pożywkę różnicującą 0–1 na dzień.
3. Odessać E8 z konfluentu, gotowego do rozszczepienia hPCS, i umyć naczynie 2x za pomocą 1x PBS.
4. Dodać 7 ml 0,25 M EDTA na 100 mm szalkę, inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, przez 15 min.
   nuta: W tym momencie leczenie EDTA jest przedłużane, aby rozproszyć się na pojedyncze komórki.
5. Odpipetować wszystkie hPSC (powinny być pływające) i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj taką samą ilość lub więcej 1x PBS jako roztworu EDTA, aby rozcieńczyć EDTA.
6. Wirować przy 200 x g przez 4 min.
7. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml pożywki różnicującej dnia 0–1 i pipetować w celu homogenizacji komórek. Następnie dodaj więcej pożywki, a następnie wymieszaj, aby rozcieńczyć roztwór komórek do stężenia idealnego do policzenia komórek.
   nuta: Nie należy nadmiernie rozcieńczać roztworu komórkowego. Na początek komórki z jednej pełnej płytki o średnicy 100 mm należy rozcieńczyć w 5 ml pożywki.
8. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
9. Rozcieńczyć roztwór komórek w razie potrzeby, aby osiągnąć 125 000 komórek/^cm2 w małej objętości końcowej (np. 2 ml na dołek dla naczynia 6-dołkowego lub 500 μl na dołek dla naczynia 24-dołkowego).
   nuta: Mała objętość pomaga komórkom szybciej się przyczepić.
10. Odessać cały roztwór matrycy błony podstawnej z powlekanych naczyń i umieścić roztwór komórkowy w studzienkach.
11. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .

3. Indukcja komórek grzebienia nerwowego (dzień 1 do dnia 10, Rysunek 1A)

1. W dniu 1 nakarm komórki pożywką różnicującą dnia 0-1 (3 ml na dołek na 6 dołków i 1 ml na dołek na 24 dołki).
2. W dniu 2 nakarm komórki pożywką różnicującą dnia 2–10 (3 ml na dołek na 6 dołków i 1 ml na dołek na 24 dołki).
3. Od tej pory komórki powinny być karmione co drugi dzień aż do 10 dnia (tj. następny dzień karmienia będzie dniem 4).
   nuta: Od 6 dnia powinny być wykrywane grzbiety NC (ryc. 1B). Aby sprawdzić, czy zachodzi różnicowanie, zaleca się przeprowadzenie równoległej kultury różnicowania w mniejszych studzienkach (tj. 24 dołkach), które można wybarwić pod kątem SOX10 / AP2a i wykorzystać do ekspresji genów markerowych w czasie różnicowania (ryc. 1B, C).
4. Jeśli sortujesz komórki, przejdź do sekcji 4. W przeciwnym razie przejdź do sekcji 5.

4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) dla markera grzebienia nerwowego CD49D i agregacja komórek NC w sferoidach

UWAGA: Do sortowania metodą FACS, próbki powinny być trzymane na lodzie i nie powinny być wystawione na działanie światła po barwieniu aż do momentu sortowania.

1. Przygotuj bufor FACS, jeśli komórki są posortowane.
2. Przygotować pożywkę sferoidalną z dnia 10–14.
3. W dniu 10 usuń pożywkę i przemyj 1x 1x PBS.
4. Dodać roztwór dysocjacyjny (patrz tabela materiałów) w ilości 2 ml na studzienkę dla płytki 6-dołkowej lub 1 ml na studzienkę dla płytki 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 20 minut.
5. Odpipetować wszystkie hPSC i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.
6. Napełnij pozostałą część probówki buforem FACS i odwiruj przy 200 x g przez 4 min.
   nuta: Każda probówka o pojemności 50 ml może pomieścić do 20 ml lub mniej roztworu komórkowego. Objętość buforu FACS powinna być wystarczająco duża, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny.
7. Odrzuć supernatant, ponownie zawieś komórki odpowiednią ilością buforu FACS (~ 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej) i policz w celu określenia liczby komórek.
8. Przygotuj następujące próbki.
   1. Próbka 1 (niebarwiona kontrola): 1 x 10⁶ komórek w 400 μl buforu FACS. Przefiltruj komórki przez nasadkę sitka o średnicy 20 μm i trzymaj probówkę na lodzie.
   2. Próbka 2 (tylko kontrola DAPI): 1 x 10⁶ komórek w 400 μL buforu FACS zawierającego 0,5 ug / ml 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). Przefiltruj komórki przez probówkę FACS z nasadką sitka i trzymaj probówkę na lodzie.
   3. Próbka 3 (znakowana CD49D): Zawiesić resztę komórek za pomocą buforu FACS zawierającego przeciwciało CD49D sprzężone z fikoerytryną/cyjaniną7 (PE/Cy7) (5 μl dla 1 x 106 komórek na 100 μl buforu FACS) w probówce o pojemności 15 ml i inkubować na lodzie przez 20 minut.
9. Napełnij probówki buforem FACS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty.
10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić co 5–10^{x 10 6} komórek w 1 ml buforu FACS zawierającego 0,5 ug/ml DAPI zgodnie z instrukcjami producenta.
11. Przefiltruj komórki przez probówkę FACS za pomocą nasadki sitka i utrzymuj probówkę na lodzie.
12. Przygotować probówki zbiorcze FACS zawierające 2 ml buforu FACS.
13. Sortuj maszynę FACS za pomocą laserów, które mogą wykrywać DAPI i PE-Cy7 w celu wyizolowania populacji CD49D⁺.
14. Po posortowaniu policz posortowane komórki.
15. Odwirować wszystkie posortowane komórki i ponownie zawiesić w dniu 10–14 pożywkę sferoidalną do końcowego stężenia 0,5 x 10⁶ komórek na 500 μl pożywki.
16. Płytka 0,5 x 10⁶ komórek na dołek do 24-dołkowych płytek o bardzo niskim mocowaniu.
17. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .

5. Agregacja komórek NC w sferoidach

1. Jeśli nie używasz FACS do izolowania komórek NC, a zamiast tego agregujesz je bezpośrednio w sferoidy, najpierw przygotuj komórki zgodnie z opisem w krokach 4.2–4.5.
2. Napełnij resztę probówki 1x PBS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty.
3. Odrzuć supernatant, ponownie zawieś komórki odpowiednią ilością pożywki sferoidalnej z dnia 10-14 (np. ~ 2 ml pożywki na dołek dla płytki 6-dołkowej) i policz w celu określenia liczby komórek.
4. Rozcieńczyć komórki w pożywce sferoidalnej dnia 10–14 do 0,5 x 10⁶ komórek na 500 μl pożywki.
5. Płytka: 500 μl zawiesiny komórek na dołek na płytkach 24-dołkowych o bardzo niskim mocowaniu.
6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .

6. Utrzymanie sferoidów NC i indukcja współczulnych progenitorów (od 10 do 14 dnia, Rysunek 3A)

1. Opcja 1: Minimalna hodowla sferoidów
   1. W dniu 11 dodać 500 μl pożywki sferoidalnej dnia 10–14 do sferoid NC bez zasysania istniejącej pożywki od 10 dnia. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO₂ .
   2. W dniu 12 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy NC po jednej stronie studzienek. Ostrożnie odessać i wyrzucić jak najwięcej pożywki i nakarmić 1 ml pożywki sferoidalnej z dnia 10–14.
   3. Kontynuuj karmienie komórek codziennie do 14 dnia.
   4. Opcjonalnie: Jeśli sferoidy agregują się i tworzą dużą grudkę, użyj pipety, aby rozbić sferoidalne grudki. Gwarantuje to również, że poszczególne sferoidy nie stają się zbyt duże.
      nuta: Idealny zakres rozmiarów sferoidów powinien wynosić około 100–500 μm. W tym zakresie wielkość poszczególnych sferoid nie jest krytyczna. Jednak morfologia, taka jak gładkie i wyraźne krawędzie (Rysunek 2 i Rysunek 4) jest ważna dla dalszego sukcesu. W dniu 14 każda 24-dołkowa płytka zawiera idealnie około 50-60 sferoid o różnych rozmiarach w wyżej wymienionym zakresie rozmiarów.
2. Opcja 2: Rozszerzona hodowla sferoidów
   1. W dniu 15, aby utrzymać sferoidy NC, nakarm 1,5 ml sferoidalnej pożywki z dnia 10–14 zawierającej 0,5 μM RA. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      nuta: RZS należy dodawać świeże do każdego karmienia i zawsze przechowywać w temperaturze -80 °C.
   2. Od tej pory karmić co drugi dzień do 28 dnia, a następnie kontynuować posiewanie sferoid (sekcja 7.1).
      nuta: Rosnące sferoidy są dzielone około 1 raz w tygodniu poprzez pipetowanie ich pipetą o pojemności 1 ml w celu ich rozdrobnienia. Są one dzielone w przybliżeniu w stosunku 1:2–1:4. W ciągu 2-tygodniowego okresu ekspansji liczba komórek powinna wzrosnąć około czterokrotnie.

7. Różnicowanie i dojrzewanie neuronu współczulnego (SymN) (Opcja 1: po 14 dniu; Opcja 2: po 28 dniu)

1. Sferoidy galwaniczne w zwykłych naczyniach
   1. Przygotuj 24-dołkowe płytki powlekane PO/LM/FM.
   2. Przygotuj pożywkę symN zawierającą 0,125 μM RA (dodawać świeże przy każdej karmie) i 10 μM Y27632 (tylko dzień 14).
   3. W dniu 14 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy NC po jednej stronie studzienek. Ostrożnie odessać i wyrzucić jak najwięcej pożywki i nakarmić 1 ml pożywki symN.
   4. Usuń LM/FN z powlekanych płyt.
   5. Podziel i płytkuj każdą studzienkę z płytki 24-dołkowej do 4 oddzielnych dołków nowej, powlekanej płytki 24-dołkowej. Każda oryginalna studzienka będzie miała 1 ml, zawierającą ~50-60 sferoid. Daje to 250 μl, zawierających około 10–15 sferoid na każdą studzienkę na nowej płytce.
   6. Dodać 250 μl dodatkowej pożywki na dołek.
      nuta: Jest to podział 1:4; Upewnij się, że sferoidy są prawidłowo rozmieszczone w roztworze, tak aby podział był w miarę równy. Liczba sferoid nie jest zliczana, ponieważ ostateczna liczba nie ma wpływu na powodzenie generowania symN.
   7. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   8. W dniu 15 (lub dniu 29 w przypadku opcji 2) karmić, zastępując całą pożywkę 1 ml pożywki symN zawierającej 0,125 μM RA. Od tej pory neurony powinny być karmione co 2 dni do 20 dnia (lub 35 dnia w przypadku opcji 2).
   9. Po 20 dniu (lub 35 dniu dla opcji 2) neurony powinny być karmione, ostrożnie wymieniając tylko połowę istniejącego podłoża (500 μl). Od teraz karm co tydzień, chyba że podłoże szybko żółknie.
   10. Kontynuuj karmienie co tydzień, aż do pożądanego punktu czasowego.
       UWAGA: symN mają tendencję do agregacji w strukturach podobnych do zwojów i są podatne na odrywanie się od szalek hodowlanych. Aby temu zapobiec, zaleca się karmienie w połowie i minimalne obchodzenie się z nim.

Wyniki

Rysunek 1: Indukcja NC. (A) Oś czasu i metody leczenia indukcji NC od dnia 0 do dnia 10. (B) Morfologię i tworzenie grzbietów NC monitorowano co 2 dni za pomocą mikroskopii jasnego pola. Komórki w każdym punkcie czasowym po dniu 2 były barwione pod kątem AP2A (czerwony) i SOX10 (zielony). Wszystkie obrazy immunofluorescencyjne zostały wybarwione przeciwstawnie DAPI....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki do hodowli komórkowych 100 mm	sokół	353003
15 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowych	VWR/Corning	Numer katalogowy: 89039-664
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	sokół	353047
24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniu	Corning	07 200 601 oraz 07 200 602
5% CO2/20% O2 inkubator do hodowli tkankowych	Thermo Fisher/Technologie Życia	Heracell VIOS 160i
50 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowych	VWR/Corning	Numer katalogowy: 89039-656
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Costar	Numer katalogowy: 3516
Dokładności	Innowacyjne technologie komórkowe	AT104500	Rozwiązanie do dysocjacji komórek
Przeciwciało anty-AP2a	Księga Abcam	ab108311	Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:400
Przeciwciało anty-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Gospodarz: mysz IgG1; rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-CD49D	Legenda biologiczna	304313	Gospodarz: mysz IgG1; 5 μl/milion komórek w objętości 100 μl
Przeciwciało anty-CD49D (izotyp)	Legenda biologiczna	400125	Gospodarz: mysz IgG1; 5 μl/milion komórek w objętości 100 μl
Przeciwciało anty-DAPI	Sigma	Zobacz materiał D9542	Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-DBH	Gwiazda immunologiczna	Numer katalogowy: 22806	Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFP	Księga Abcam	ab13970	Gospodarz: Kurczak; rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-HOXC9	Biotechnologia Santa Cruz	SC-365692	Gospodarz: mysz IgG1; rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-NET1	Mab	NET17-1	Gospodarz: Mysz; rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-PRPH	Biotechnologia Santa Cruz	SC-377093/H0112	Gospodarz: mysz IgG2a; rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-SOX10	Księga Abcam	ab50839	Gospodarz: Mysz; rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-TH	Pel-Zamrażak	Zobacz materiał P40101-150	Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:500
kwas askorbinowy	Sigma	A8960-5G	Koncentracja zapasów: 100 mM
Suplement witaminy B27	Thermo Fisher/Technologie Życia	Numer katalogowy: 12587-010	Koncentracja zapasów: 50x
BDNF powiedział:	Systemy badawczo-rozwojowe	Zobacz materiał 248-BD	Stężenie podstawowe: 10 μg/ml
Zobacz materiał BMP4	Systemy badawczo-rozwojowe	314-BP	Koncentracja zapasów: 6 mM
Licznik komórek	Thermo Fisher/Technologie Życia	Hrabina II
Szkiełka komory zliczania komórek	Invitrogen	Zobacz materiał C10312
wirówka	Eppendorf	57021&5424R
CHIR99021	Systemy badawczo-rozwojowe	Numer katalogowy: 4423	Koncentracja zapasów: 6 mM
Kriofiolka	Thermo Fisher/Technologie Życia	375353
dbcAMP (wzmacniacz dbcAMP	Sigma	Zobacz materiał D0627	Koncentracja zapasów: 100 mM
DMEM (DMEM)	Thermo Fisher/Technologie Życia	Numer katalogowy: 10829-018	Stężenie w magazynie: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Technologie Życia	Numer katalogowy: 11330-057	Stężenie w magazynie: 1x
Dmso	Thermo Fisher/Technologie Życia	Zobacz materiał BP231-100
E6 średni	Certyfikat Gibco	A15165-01
E8 średni	Certyfikat Gibco	A15169-01	Stężenie w magazynie: 1x
Suplement E8	Certyfikat Gibco	A15171-01	Koncentracja zapasów: 50x
Edta	Sigma	Przekaźnik ED2SS	Koncentracja stada: 0,5 M
Maszyna FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (dla FACS)
Maszyna FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (do sortowania)
Rurki FACS (niebieska nasadka filtra)	sokół	352235
Rurki FACS (biała nasadka)	sokół	352063
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Certyfikat GDNF	PeproTech	450	Stężenie podstawowe: 10 μg/ml
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Macierz błony podstawnej; Koncentracja zapasów: 100x
Komórki komórkowe w związku z zapytaniami	Thomson i wsp., (1998)	WA09
Komórki komórkowe w związku z zapytaniami	Oh i in. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Ludzka fibronektyna (FN)	VWR/Corning	Numer katalogowy: 47743-654	Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
L-glutamina	Thermo Fisher/Gibco	25030-081	Koncentracja zapasów: 200 mM
Zbiornik LN	Niestandardowe systemy biogenne	V-1500AB
Laminina myszy I (LM)	Systemy badawczo-rozwojowe	3400-010-01	Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
Suplement N2	Thermo Fisher/Technologie Życia	Numer katalogowy: 17502-048	Koncentracja zapasów: 100x
Podłoże nerwowo-podstawowe	Certyfikat Gibco	21103-049	Stężenie w magazynie: 1x
NGF (Elektrownia Rol	PeproTech	450-01	Stężenie magazynowe: 25 μg/ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-136	Stężenie w magazynie: 1x
Bromowodorek poli-L-ornityny (PO)	Sigma	Zobacz materiał P3655	Stężenie podstawowe: 15 mg/ml
Primocyna (antybiotyki)	InvivoGen	ANTPM1	Stężenie podstawowe: 50 mg/ml
Maszyna do qPCR	Laboratoria Bio-Rad	C1000 Dotyk
Płytki qPCR	Laboratoria Bio-Rad	HSP9601
rekombinowany FGF2	Systemy badawczo-rozwojowe	233-FB/CF	Stężenie podstawowe: 10 μg/ml
Kwas retinowy	Sigma	Czynnik R2625	Stężenie zapasów: 1 mM
SB431542	Tocris/Systemy badawczo-rozwojowe	Rok 1614	Stężenie zapasów: 10 mM
Trypan niebieski	Corning	MT-25-900-CI
Witronektyna (VTN)	Thermo Fisher/Technologie Życia	Certyfikat A14700	Stężenie podstawowe: 0,5 mg/ml
Kąpiel wodna	VWR/Corning	706308
Y27632	Systemy badawczo-rozwojowe	1254	Stężenie zapasów: 10 mM