Method Article

Generowanie zazwojowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Wu, H. F., et al. Efektywne różnicowanie pozazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę in vitro do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w komórki grzebienia nerwowego (NCC) na podporze macierzy błony podstawnej za pomocą pożywki różnicującej. NCC są następnie dysocjowane i formowane w sferoidy za pomocą innego ośrodka różnicującego. Wreszcie sferoidy są przekształcane w pozazwojowe neurony współczulne za pomocą współczulnego ośrodka neuronowego.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do powlekania potraw, przygotowania podłoża i konserwacji hPSC

  1. Panierowanie naczyń
    1. Powłoka z witronektyną (VTN)
      1. Umieścić fiolki z VTN w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozmrożenia, a następnie dokładnie wymieszać.
      2. W przypadku szalki Petriego o średnicy 100 mm zmieszaj 7 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 0,5 mg/ml VTN, dodaj roztwór VTN do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
    2. Powłoka matrycy membrany podstawnej
      1. Rozmrozić fiolki z matrycą błony p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Indukcja NC. (A) Oś czasu i metody leczenia indukcji NC od dnia 0 do dnia 10. (B) Morfologię i tworzenie grzbietów NC monitorowano co 2 dni za pomocą mikroskopii jasnego pola. Komórki w każdym punkcie czasowym po dniu 2 były barwione pod kątem AP2A (czerwony) i SOX10 (zielony). Wszystkie obrazy immunofluorescencyjne zostały wybarwione przeciwstawnie DAPI........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szalki do hodowli komórkowych 100 mmsokół353003
15 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowychVWR/CorningNumer katalogowy: 89039-664
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychsokół353047
24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniuCorning07 200 601 oraz 07 200 602
5% CO2/20% O2 inkubator do hodowli tkankowychThermo Fisher/Technologie ŻyciaHeracell VIOS 160i
50 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowychVWR/CorningNumer katalogowy: 89039-656
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCostarNumer katalogowy: 3516
DokładnościInnowacyjne technologie komórkoweAT104500Rozwiązanie do dysocjacji komórek
Przeciwciało anty-AP2aKsięga Abcamab108311Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:400
Przeciwciało anty-Ascl1BD Pharmingen556604Gospodarz: mysz IgG1; rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-CD49DLegenda biologiczna304313Gospodarz: mysz IgG1; 5 μl/milion komórek w objętości 100 μl
Przeciwciało anty-CD49D (izotyp)Legenda biologiczna400125Gospodarz: mysz IgG1; 5 μl/milion komórek w objętości 100 μl
Przeciwciało anty-DAPISigmaZobacz materiał D9542Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-DBHGwiazda immunologicznaNumer katalogowy: 22806Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFPKsięga Abcamab13970Gospodarz: Kurczak; rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-HOXC9Biotechnologia Santa CruzSC-365692Gospodarz: mysz IgG1; rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-NET1MabNET17-1Gospodarz: Mysz; rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-PRPHBiotechnologia Santa CruzSC-377093/H0112Gospodarz: mysz IgG2a; rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-SOX10Księga Abcamab50839Gospodarz: Mysz; rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-THPel-ZamrażakZobacz materiał P40101-150Gospodarz: Królik; rozcieńczenie 1:500
kwas askorbinowySigmaA8960-5GKoncentracja zapasów: 100 mM
Suplement witaminy B27Thermo Fisher/Technologie ŻyciaNumer katalogowy: 12587-010Koncentracja zapasów: 50x
BDNF powiedział:Systemy badawczo-rozwojoweZobacz materiał 248-BDStężenie podstawowe: 10 μg/ml
Zobacz materiał BMP4Systemy badawczo-rozwojowe314-BPKoncentracja zapasów: 6 mM
Licznik komórekThermo Fisher/Technologie ŻyciaHrabina II
Szkiełka komory zliczania komórekInvitrogenZobacz materiał C10312
wirówkaEppendorf57021&5424R
CHIR99021Systemy badawczo-rozwojoweNumer katalogowy: 4423Koncentracja zapasów: 6 mM
KriofiolkaThermo Fisher/Technologie Życia375353
dbcAMP (wzmacniacz dbcAMPSigmaZobacz materiał D0627Koncentracja zapasów: 100 mM
DMEM (DMEM)Thermo Fisher/Technologie ŻyciaNumer katalogowy: 10829-018Stężenie w magazynie: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Technologie ŻyciaNumer katalogowy: 11330-057Stężenie w magazynie: 1x
DmsoThermo Fisher/Technologie ŻyciaZobacz materiał BP231-100
E6 średniCertyfikat GibcoA15165-01
E8 średniCertyfikat GibcoA15169-01Stężenie w magazynie: 1x
Suplement E8Certyfikat GibcoA15171-01Koncentracja zapasów: 50x
EdtaSigmaPrzekaźnik ED2SSKoncentracja stada: 0,5 M
Maszyna FACSBeckman CoulterCytoFLEX (dla FACS)
Maszyna FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (do sortowania)
Rurki FACS (niebieska nasadka filtra)sokół352235
Rurki FACS (biała nasadka)sokół352063
Surowica płodowa bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Certyfikat GDNFPeproTech450Stężenie podstawowe: 10 μg/ml
GeltrexInvitrogenA1413202Macierz błony podstawnej; Koncentracja zapasów: 100x
Komórki komórkowe w związku z zapytaniamiThomson i wsp., (1998)WA09
Komórki komórkowe w związku z zapytaniamiOh i in. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Ludzka fibronektyna (FN)VWR/CorningNumer katalogowy: 47743-654Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081Koncentracja zapasów: 200 mM
Zbiornik LNNiestandardowe systemy biogenneV-1500AB
Laminina myszy I (LM)Systemy badawczo-rozwojowe3400-010-01Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
Suplement N2Thermo Fisher/Technologie ŻyciaNumer katalogowy: 17502-048Koncentracja zapasów: 100x
Podłoże nerwowo-podstawoweCertyfikat Gibco21103-049Stężenie w magazynie: 1x
NGF (Elektrownia RolPeproTech450-01Stężenie magazynowe: 25 μg/ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco (firma Gibco)Nr kat. 14190-136Stężenie w magazynie: 1x
Bromowodorek poli-L-ornityny (PO)SigmaZobacz materiał P3655Stężenie podstawowe: 15 mg/ml
Primocyna (antybiotyki)InvivoGenANTPM1Stężenie podstawowe: 50 mg/ml
Maszyna do qPCRLaboratoria Bio-RadC1000 Dotyk
Płytki qPCRLaboratoria Bio-RadHSP9601
rekombinowany FGF2Systemy badawczo-rozwojowe233-FB/CFStężenie podstawowe: 10 μg/ml
Kwas retinowySigmaCzynnik R2625Stężenie zapasów: 1 mM
SB431542Tocris/Systemy badawczo-rozwojoweRok 1614Stężenie zapasów: 10 mM
Trypan niebieskiCorningMT-25-900-CI
Witronektyna (VTN)Thermo Fisher/Technologie ŻyciaCertyfikat A14700Stężenie podstawowe: 0,5 mg/ml
Kąpiel wodnaVWR/Corning706308
Y27632Systemy badawczo-rozwojowe1254Stężenie zapasów: 10 mM
powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: szt. powiedział: szt. powiedział: powiedział: powiedział: szt.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsNeural Crest CellsSympathetic Neuron DifferentiationBasement Membrane MatrixSpheroid FormationRetinoic Acid TreatmentNeural Progenitor CellsPeripheral Nervous SystemCell Culture IncubatorEDTA Dissociation

Related Articles