$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowania
- Przygotować 10 ml pożywki preparacyjnej i dodać 200 μl 100x penicyliny-streptomycyny do 9,8 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle F12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco.
- Przygotować roztwór L-cysteiny: do 10 ml wody do hodowli tkankowej i dodać 120 mg L-cysteiny. Roztwór L-cysteiny należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni lub w porcjach w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
- Przygotować roztwór DNazy I: do 1 ml wody do hodowli tkankowej dodać 10 mg DNazy I. Roztwór DNazy I należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
- Przygotuj roztwór papainy: aby przygotować roztwór papainy, dodaj 100 μl papainy (około 140 jednostek), 100 μl DNazy I (1%) i 200 μl L-cysteiny (12 mg/ml) do 5 ml DMEM/F12. Za każdym razem należy świeżo przygotować roztwór papainy i przed użyciem wysterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm.
- Przygotować roztwór myjący: aby przygotować 100 ml roztworu myjącego, dodać 650 μl glukozy 45%, 500 μl kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego, HEPES 1 M i 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 93,85 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) 1x. Przed użyciem wysterylizuj roztwór myjący filtrem o wielkości porów 0,22 μm. Roztwór myjący należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
- Przygotuj roztwór insuliny: aby przygotować 2 ml roztworu insuliny, dodaj 25 μl kropli 10 N wodorotlenku sodu (NaOH) i 100 mg insuliny do 2 ml wody w celu hodowli tkankowej.
- Przygotować roztwory naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF): Rozpuścić oba mitogeny w DMEM/F12 w stężeniu 100 μg/ml. Przechowywać w postaci 10 μl porcji w temperaturze -20 °C.
- Przygotować pożywki B-27 i N-2: suplementy B-27 i N-2 przechowywać w temperaturze -20 °C odpowiednio jako podwielokrotności 500 μl i 1 ml.
- Przygotować pożywkę warunku różnicowania Z: aby przygotować 100 ml pożywki warunku różnicowania Z, dodać 40 μl insuliny (50 mg/ml), 500 μl B-27, 1 ml N-2, 650 μl glukozy 45% i 1 ml 100 x penicylina-streptomycyna do 97,81 ml DMEM/F12. Przed użyciem wysterylizuj pożywkę o stanie różnicowania Z za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm. Przechowywać pożywkę do różnicowania Z w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
- Przygotowanie pożywki w stanie Z: aby przygotować 50 ml pożywki w stanie Z, dodać 10 μl EGF i 10 μl FGF do 50 ml sterylnej pożywki w warunkach dyferencjacji Z (20 ng/ml). Pożywkę w stanie Z należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
- Przygotować roztwór powlekający do hodowli różnicowej: dla 5 ml roztworu do powlekania zewnątrzkomórkowego dodać 100 μl roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Matrigel) do 4,9 ml DMEM/F12. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej w temperaturze 4 °C na lodzie. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Sekcja mózgu dorosłego danio pręgowanego
- Przygotować łoże preparacyjne, wypełniając szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm żelowymi okładami z lodu. Następnie przykryć pokrywką szalkę Petriego i inkubować w temperaturze -20 °C, aż żel zamarznie. Na pokrywie umieść kwadrat czystej bibuły filtracyjnej i owiń zarówno bibułę filtracyjną, jak i szalkę Petriego folią z tworzywa sztucznego.
- Przed każdym użyciem wyczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia do mikrodysekcji za pomocą 70% etanolu lub ciepła. Umieść wszystkie wysterylizowane narzędzia preparacyjne w pobliżu mikroskopu preparacyjnego i tuż przed eutanazją umieść łóżko sekcyjne pod mikroskopem z oświetleniem światłowodowym.
- Zbierz 2 dorosłe rybki danio pręgowane, aby przygotować neurosferę całego mózgu, oraz 3 do 4 danio pręgowanego, aby wygenerować neurosfery z wypreparowanych obszarów mózgu.
- Poddaj eutanazji dorosłego danio pręgowanego (w wieku 8-12 miesięcy) przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Następnie zanurz rybę w 75% etanolu na 5-10 sekund i szybko umieść w łożu preparacyjnym, a następnie zdekapitalizuj na poziomie skrzeli za pomocą ostrza chirurgicznego.
- Aby poddać zwierzęta eutanazji, należy podać przedawkowanie (300 mg/l) sulfonianu metanu trikainy, aż bicie serca zwierzęcia stopniowo zwolni i ustanie krążenie, a następnie zanurz w lodowatej wodzie.
- Odwróć głowę grzbietową stroną do dołu i za pomocą nożyczek wykonaj podłużne cięcie od strony cięcia do ust. Za pomocą kleszczy odsłoń podstawę czaszki i usuń całą przylegającą tkankę. Przetnij boczne ściany czaszki od początku rdzenia kręgowego w kierunku tectum.
- Za pomocą nożyczek przetnij i usuń nerwy wzrokowe, a następnie usuń obie strony najbardziej bocznej części czaszki na poziomie tectum. Obróć głowę brzuszną stroną do góry. Za pomocą kleszczy oderwij resztę najbardziej wierzchołkowej części czaszki.
- Przenieść mózg wraz z pozostałą częścią czaszki do nowego naczynia z podłożem do preparacji (1.1). Oczyść tkankę mózgową w podłożu preparacyjnym za pomocą plastikowego uchwytu mikronoża, zachowując wszystkie struktury mózgu w stanie nienaruszonym.
- Od tego momentu kontynuuj protokół, używając całego mózgu danio pręgowanego.
- Alternatywnie dostosuj ten protokół do określonych obszarów mózgu, aby wygenerować neurosfery z całego mózgu danio pręgowanego lub z kresomózgowia, tectum/międzymózgowia lub móżdżku wyciętego świeżym skalpelem. Użyj neuronalnej specyficznej dla fluorescencyjnej neuronalnej linii transgenicznej danio pręgowanego, aby przeanalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zgodnie z ryciną 1.
3. Dysocjacja pojedynczej komórki dorosłego mózgu
- Wszystkie późniejsze prace należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść tkankę mózgową do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 800 μl pożywki preparacyjnej (przygotowanej w kroku 1.1). Usunąć pożywkę preparacyjną za pomocą pipetowania, nie dotykając tkanki mózgowej.
- Dodać 500 μl roztworu papainy (krok 1.4) i trawić tkankę mózgową w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Nie inkubować dłużej niż 15 minut, ponieważ może to zmniejszyć żywotność komórek.
- Po inkubacji przenieś tkankę mózgową z 500 μl roztworu papainy do stożkowej rurki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki pipety o pojemności 1,000 μl wyciętej w odległości ~0,25 cala od dna. Delikatnie rozdziel tkankę mózgową, powoli pipetując w górę i w dół 10 razy tą samą końcówką. Nie należy pipetować w górę i w dół więcej niż 15 razy i nie wytwarzać pęcherzyków powietrza na tym etapie, ponieważ może to wpłynąć na żywotność komórek.
- Ponownie inkubować tkankę mózgową w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie pipetować w górę i w dół 10-13 razy za pomocą nieobciętej końcówki o pojemności 1000 μl. Nie pipetować w górę i w dół więcej niż 15 razy, aby uniknąć śmierci komórki.
- Zatrzymać trawienie enzymatyczne przez dodanie 2 ml roztworu myjącego (krok 1.5) i odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w pozostałym roztworze, energicznie stukając palcem w probówkę, a następnie pipetując w górę i w dół za pomocą zwykłej końcówki o pojemności 1 000 μl. Następnie dodaj 2 ml roztworu myjącego.
- Na tym etapie należy sprawdzić pod mikroskopem, czy uzyskano zawiesinę pojedynczej komórki. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, używając 1 ml świeżej pożywki o stanie Z (krok 1.10).
- Wybarwić komórki za pomocą błękitu trypanowego i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru, wykluczając niebieskie martwe komórki. Przygotować 24-dołkową płytkę z 200 μl zawiesiny komórek i 300 μl świeżej pożywki w stanie Z w każdym dołku. Komórki nasienne o gęstości ~500 komórek/μl. Hodowane komórki należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 30 °C w 5% CO2 , ponieważ neurosfery pochodzące z mózgu danio pręgowanego nie rosną dobrze w temperaturze 37 °C.
4. Generacja pierwotnych neurosfer
- Po 1 dniu in vitro (DiV1) obserwuj pod mikroskopem zawiesinę pojedynczych komórek uzyskaną z dorosłego całego mózgu i zwróć uwagę, czy w środku studzienki nagromadziły się zanieczyszczenia. Ostrożnie usunąć wszelkie zanieczyszczenia, pipetując około 100 μl pożywki (mniej, jeśli to możliwe). Następnie dodać 100 μl świeżej pożywki o stanie Z. W tym czasie należy obserwować zawiesiny pojedynczych komórek (ryc. 2A DiV1).
- Po 2 dniach in vitro (DiV2) rozpręż hodowane komórki. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z naciętą końcówką zbierz i przenieś 250 μl zawiesiny komórek z każdej studzienki do nowej studzienki. Dodać 250 μl świeżej pożywki o stanie Z do wszystkich studzienek. Przed rozszerzeniem hodowanych komórek należy bardzo delikatnie homogenizować zawiesinę, pipetując w górę iw dół w całym dołku.
- Powtórzyć kroki 4.1 i 4.2 przez następne 4 dni in vitro (DiV4). Postępujący wzrost rozmiarów neurosfer powinien być widoczny w środku i na krawędziach studzienki w DiV3 i DiV4 (ryc. 2B i C).
nuta: Pierwotne neurosfery mogą być przetwarzane pod kątem przejścia lub różnicowania w celu oceny multipotencji. Alternatywnie można je przetworzyć pod kątem nukleofekcji lub lipotransfekcji, aby scharakteryzować rolę określonych genów podczas procesu różnicowania.
5. Pasażowanie pierwotnych neurosfer
- Usunąć 250 μl kultury tkankowej z każdej studzienki i mechanicznie zdysocjować neurosfery DiV4 za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie należy pipetować w górę i w dół zbyt szybko, ponieważ tworzenie się pęcherzyków powietrza może zwiększyć śmierć komórek.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozprowadź 800 komórek/μl w 250 μl supernatantu do hodowli pierwotnej do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.
- Dodać 250 μl pożywki o stanie Z do każdego dołka.
- Po 2 dniach in vitro (DiV2) rozprężyć wyhodowane komórki, jak opisano w krokach 4.2 i 4.3.
6. Różnicowanie pierwotnych neurosfer
- Sterylizuj szkła nakrywkowe przez zanurzenie w 70% etanolu przez 10 minut, a następnie wysusz szkła nakrywkowe w temperaturze pokojowej, umieszczając je w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
- Dodać 300 μl zewnątrzkomórkowego roztworu powlekającego (krok 1.11) na środek szkła nakrywkowego w taki sposób, aby mogło się ono szeroko rozszerzyć i pokryć całe szkło nakrywkowe. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (przy użyciu nawilżanego inkubatora do hodowli komórkowych).
- Po inkubacji usunąć zewnątrzkomórkowy roztwór powlekający i suszyć szkło nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Usunąć 250 μl kultury tkankowej z każdej studzienki. Mechanicznie oddzielić wszystkie pierwotne neurosfery DiV4 na studzienkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml (z szerszą końcówką), pipetując w górę iw dół.
- Nasiona dysocjowanych zawiesin komórek neurosfery o gęstości komórek 4 x 103 komórki/ml na uprzednio przygotowanych szkłach nakrywkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (etap 6.1-6.3) i przechowywać przez co najmniej 30 minut, w temperaturze 30 °C w 5% CO2 , aż do przyłączenia do podłoża. Następnie usunąć pożywkę hodowlaną i szybko dodać 1 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki do różnicowania Z (krok 1.9) przed hodowlą komórek przez 24 godziny w temperaturze 30 °C w 5% CO2 .
- Co dwa dni wymieniaj połowę pożywki warunkowej różnicowania Z w czasie różnicowania komórek.
