Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Generacja organoidów mózgowych (23 dni)
- Rozpoczęcie neuroektodermy (5 dni)
UWAGA: Przed rozpoczęciem różnicowania należy wziąć pod uwagę następujące punkty. Metoda przeprogramowania (oparta na lentiwirusie, wirusie sendai, episomalnym lub mikroRNA itp.) w celu uzyskania ludzkich iPSC powinna być w idealnym przypadku taka sama dla wszystkich linii iPSC pacjenta i grupy kontrolnej. Dostępne są różne zestawy do przeprogramowania i instrukcje oparte na opublikowanych protokołach. Jakość ludzkich linii iPSC jest kluczem do osiągnięcia optymalnego zróżnicowania. Monitoruj morfologię kolonii i komórek za pomocą mikroskopu i weryfikuj pluripotencję, testując ekspresję markerów, takich jak Oct3/4, Nanog lub TRA-1-60.
- Hodowla ludzkich iPSC w warunkach wolnych od karmienia w pożywce A na szalce pokrytej matrycą Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
nuta: Hodować ludzkie iPSC bez karmienia i surowicy, aby utrzymać określone warunki hodowli i uniknąć dodatkowego etapu usuwania mysich embrionalnych komórek żywicielskich (MEF) przed rozpoczęciem różnicowania. Optymalna liczba pasaży dla ludzkich iPSC, aby rozpocząć różnicowanie, waha się od przejścia 15 po przeprogramowaniu do przejścia 70 ogółem. Podczas pasażowania należy odłączyć kolonie hiPSC w miarę agregacji komórek za pomocą odpowiedniego roztworu do odrywania komórek o niskim naprężeniu mechanicznym i pipety serologicznej o pojemności 2 ml w celu przeniesienia agregatów do nowego naczynia. Należy unikać dysocjacji na pojedyncze komórki, ponieważ może to wywołać różnicowanie i apoptozę w większości linii iPSC. Doniesiono, że długotrwałe pasażowanie pojedynczych komórek może zwiększyć zmiany genomowe w ludzkich iPSC. Należy unikać procedur oddzielania komórek, które wymagają etapu wirowania w celu usunięcia roztworu oddzielającego, ponieważ zmniejsza to ogólną żywotność iPSC. Należy regularnie badać wszystkie kultury pod kątem zanieczyszczeń mikrobiologicznych, w szczególności mykoplazmy, ponieważ może to wpłynąć na jakość iPSC i ich zdolność do różnicowania.
- Pokryj naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm matrycą EHS zgodnie z instrukcjami producenta.
- Rozmrozić podwielokrotność 1 x 106 ludzkich iPSC. Zasiać iPSC w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej pokrytym matrycą EHS i zawierającym 5 ml pożywki A (patrz tabela materiałów). Zmieniaj pożywkę codziennie i pasaż po 5 do 7 dniach, gdy komórki osiągną ~80% konfluencji.
nuta: Przejście rozmrożonych iPSC przy 80% konfluencji przy użyciu standardowych metod, takich jak oderwanie kolonii bez enzymów, co najmniej raz przed rozpoczęciem różnicowania. Krótko mówiąc, usuń pożywkę iPSC, umyj komórki wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco i inkubuj iPSC zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu odczynnika A (patrz tabela materiałów). Nie przekraczaj zalecanego czasu inkubacji, aby uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki. Ludzkie komórki iPS powinny być oderwane i unoszące się w powietrzu jako agregaty, a nie jako pojedyncze komórki. Następnie można je przenieść do nowych naczyń pokrytych matrycą EHS; na przykład agregaty iPSC z jednej szalki 60 mm można rozprowadzić do 4 nowych szalek 60 mm.
b. Sprawdź obecność mykoplazmy za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazmy zgodnie z instrukcjami producenta. Należy stosować wyłącznie iPSC wolne od mykoplazmy, ponieważ mykoplazma może zmieniać zdolność różnicowania iPSC.
- Dysocjuj iPSC (80% konfluentu) i przygotuj zawiesinę jednokomórkową za pomocą odczynnika B
- Umyj iPSC raz za pomocą wstępnie ogrzanego (37 °C) DMEM/F12.
- Dodać wstępnie podgrzany odczynnik B (np. 1 ml w naczyniu o średnicy 60 mm) i inkubować iPSC przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przesuń 20 razy opuszkiem palca po boku i na dole naczynia, aby odłączyć iPSC. Sprawdź, czy komórki nie oderwały się pod mikroskopem.
- Odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół w naczyniu 5 razy za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
- Dodać 3 ml pożywki A, aby rozcieńczyć 1 ml odczynnika B i zebrać zawiesinę komórek w 15 ml probówce wirówkowej.
- Delikatnie odwirowywać iPSC (500 x g) przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki B i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
nuta: Należy pamiętać, że do ponownego zaparcia należy używać wyłącznie podłoża B. Unikaj stosowania pożywki A, ponieważ zawiera ona zbyt wysokie stężenie bFGF, co może hamować różnicowanie.
- Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 4,5 x 105 komórek na ml w pożywce B uzupełnionej inhibitorem kinazy białkowej związanej z 10 μM rho (Y-27632).
- Dodać 100 μl na studzienkę do nieprzylegającej, 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
nuta: Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, potrząsając probówką za każdym razem przed wyjęciem porcji 100 μl. Ważne jest, aby każda studzienka zawierała równoważną liczbę komórek, aby uzyskać neurosfery jednorodne pod względem wielkości i kształtu (okrągłe, określone powierzchnie).
- Delikatnie odwirować płytkę z komórkami o sile 500 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zmieniaj pożywkę codziennie, usuwając 50 μl i dodając 50 μl świeżej pożywki B do każdej studzienki przez następne 5 dni.
2. Osadzanie neurosfer w matrycy EHS (4 dni)
- Przygotuj pożywkę neurosferyczną, mieszając następujące elementy: mieszanina 1:1 DMEM/F12 i pożywki C (v/v), 1:200 (v/v) suplement 1, 1:100 (v/v) suplement 2 bez (w/o) witaminy A, 1:100 L-glutaminy, 0,05 mM aminokwasów endogennych (MEM), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1,6 g/l insuliny i 0,05 mM β-merkaptoetanolu.
- Zebrać neurosfery za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl za pomocą końcówki o średnicy ~2 mm, uprzednio przeciętej sterylnymi nożyczkami.
- Umieść neurosfery w odległości około 5 mm od siebie na folii parafinowej (3 x 3 cm2) w pustym naczyniu o średnicy 100 mm i ostrożnie usuń jak najwięcej pozostałego podłoża.
- Dodaj kroplę (7 μl) matrycy EHS na każdą pojedynczą neurosferę.
- Inkubuj krople matrycy EHS z neurosferami przez 15 minut w inkubatorze.
- Ostrożnie umyj neurosfery z filmu parafinowego, przepłukując je podłożem neurosfery. Do przepłukania należy użyć mikropipety o pojemności 1 ml i nowej szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 10 ml pożywki neurosferycznej.
- Inkubuj neurosfery przez następne 4 dni i dodaj 2 ml świeżej pożywki neurosferycznej w dniu 2,
nuta: Upewnij się, że półki w inkubatorze są płaskie, aby neurosfery osadzone w matrycy EHS nie zlepiały się ze sobą po jednej stronie naczynia.
3. Organoidy w hodowli w zawiesinie rotacyjnej (14 dni)
- Przygotować pożywkę z organoidów mózgowych, mieszając następujące elementy: mieszanina 1:1 DMEM/F12 i pożywki C (v/v), 1:200 (v/v) suplement 1, 1:100 (v/v) suplement 2 bez witaminy A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM MEM, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1,6 g/l insuliny, 0,5 μM dorsomorfina, 5 μM SB431542, i 0,05 mM β-merkaptoetanolu.
- Dodaj 100 ml pożywki z organoidów mózgowych do każdej kolby z kołpakami przez jej boczne ramiona i umieść je w inkubatorze w celu wstępnego ogrzania przez co najmniej 20 minut.
- Ustaw program mieszania przy 25 obr./min, zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Przed przeniesieniem neurosfer osadzonych w matrycy EHS do kolb obrotowych upewnij się, że wszystkie są oddzielone. Jeśli dwie lub więcej osób jest połączonych za pomocą matrycy EHS, należy je rozdzielić, przecinając macierz łączącą skalpelem.
- Ostrożnie przenieść neurosfery osadzone w matrycy EHS do kolb obrotowych zawierających 100 ml pożywki organoidowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml. Użyj bocznych ramion kolby obrotowej, aby przenieść neurosfery do kolby.
- Umieścić kolby przędzalnicze na magnetycznej platformie mieszającej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ; jest to dzień 0 hodowli organoidów.
- Zmieniaj podłoże raz w tygodniu (lub częściej, gdy następuje zmiana koloru), usuwając połowę podłoża i dodając taką samą ilość świeżego podłoża.
nuta: Wyjmując kolby z inkubatora, należy odczekać 3-5 minut, aby organoidy opadły na dno kolby. Usunąć pożywkę, umieszczając szklaną końcówkę pipety (podłączoną do pompy) na powierzchni cieczy; Ostrożnie zassać pożywkę przez jeden boczny otwór/ramię kolby. Te manipulacje muszą być wykonywane pod maską laminarną.