Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Streszczenie

Źródło: Chang, H. et al., Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych wywołanych polem elektrycznym w urządzeniach mikroprzepływowych.J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Protokół

1. Projekt i wykonanie wielokanałowego, optycznie przezroczystego, elektrotaktycznego układu scalonego (MOE)

1. Narysuj wzory dla poszczególnych warstw polimetakrylanu metylu (PMMA) i taśmy dwustronnej za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Rysunek 1A, Tabela materiałów). Wytnij zarówno arkusze PMMA, jak i taśmę dwustronną za pomocą rysika laserowego CO₂ (Rysunek 1B).
   1. Włącz rysik laserowy CO₂ i podłącz go do komputera osobistego. Otwórz plik zaprojektowanego wzorca za pomocą oprogramowania.
   2. Umieść arkusze PMMA (275 mm x 400 mm) lub taśmę dwustronną (210 mm x 297 mm) na platformie rysika laserowego (Rysunek 2A). Ustaw ostrość laser na powierzchni arkuszy PMMA lub taśmie dwustronnej za pomocą narzędzia do automatycznego ustawiania ostrości.
   3. Wybierz rysik laserowy jako drukarkę, a następnie "wydrukuj" wzór za pomocą rysika laserowego, aby rozpocząć bezpośrednią ablację na arkuszu PMMA lub taśmie dwustronnej i uzyskać indywidualne wzory na arkuszu lub taśmie PMMA (Rysunek 2B).
2. Usuń folię ochronną z arkuszy PMMA i oczyść powierzchnię za pomocą gazowego azotu.
   nuta: Rysunek wzoru PMMA oraz bezpośrednia obróbka blachy PMMA zostały wykonane zgodnie z poprzednim raportem.
3. W celu łączenia ze sobą wielu warstw arkuszy PMMA, należy ułożyć trzy kawałki arkuszy PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1, 2 i 3) i połączyć je pod ciśnieniem 5 kg/^cm2 w spoiwarce termicznej na 30 minut w temperaturze 110 °C, aby utworzyć zespół kanału przepływu/stymulacji elektrycznej (Rysunek 2C).
   nuta: Różne partie komercyjnie otrzymywanych arkuszy PMMA mają nieco różne temperatury zeszklenia (Tg). Optymalna temperatura wiązania musi być testowana w krokach co 5 °C zbliżonych do Tg.
4. Przyklej 12 sztuk adapterów do poszczególnych otworów w warstwie 1 zespołu chipów MOE za pomocą szybko działającego kleju cyjanoakrylowego.
   nuta: Adaptery wykonane są z PMMA metodą wtrysku. Płaskie powierzchnie na dole służą do podłączenia do układu MOE. Adaptery z gwintem wewnętrznym 1/4W-28 służą do podłączania białych wtyczek dokręcanych palcami, złączy z płaskim dnem lub adapterów Luer. Zachowaj ostrożność podczas używania szybko działającego kleju cyjanoakrylowego. Unikaj rozpryskiwania się do oczu.
5. Zdezynfekuj podłoża PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3), taśmę dwustronną (warstwa 4) i 3 mm PMMA klasy optycznej (warstwa 5) za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 30 minut przed montażem chipa (rysunek 1A).
6. Przyklej podłoża PMMA o grubości 1 mm (warstwy 1-3) do 3 mm warstwy optycznej PMMA (warstwa 5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 4), aby zakończyć montaż PMMA (warstwy 1-5) (rysunek 1A).
7. Przygotuj czystą szklankę nakrywkową do montażu na chipie.
   1. Napełnij dziesięciokrotnym rozcieńczeniem detergentu do słoika do barwienia (patrz Tabela materiałów) i wyczyść szkło nakrywkowe w tym detergencie za pomocą myjki ultradźwiękowej przez 15 minut.
   2. Dokładnie opłucz słoik do barwienia pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć wszelkie ślady detergentu.
   3. Kontynuuj płukanie wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady wody z kranu i powtórz krok 1.7.2 dwa razy.
   4. Osusz oczyszczoną szklankę nakrywkową, przedmuchując ją gazowym azotem.
8. Zdezynfekuj zespół PMMA (warstwy 1-5), taśmę dwustronną (warstwa 6) i szkło nakrywkowe (warstwa 7) za pomocą promieniowania UV wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut przed montażem chipa (rysunek 1A).
9. Przyklej oczyszczoną szklaną pokrywę (warstwa 7) do zespołu PMMA (warstwy 1-5) za pomocą taśmy dwustronnej (warstwa 6) (rysunek 1A).
10. Inkubować chip MOE w komorze próżniowej przez noc; używać zespołu chipa MOE do kolejnych procedur (rysunek 3).

2. Powlekanie poli-L-lizyny (PLL) na substracie w regionach hodowli komórkowej

1. Przygotuj rurkę z politetrafluoroetylenu, złącze z płaskim dnem, złącze stożkowe, adapter stożkowy Luer, białą zatyczkę dociskową na palec (zwaną również korkiem), adapter Luer, strzykawkę Luer lock i czarną gumową zatyczkę (Rysunek 4A, Tabela materiałów). Sterylizuj wszystkie powyższe składniki w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.
2. Uszczelnij otwory adapterów mostka agarowego (Rysunek 1A) białymi zatyczkami dokręcanymi palcami. Podłącz złącze z płaskim dnem do zespołu chipa MOE za pomocą adapterów wlotu i wylotu medium (Rysunek 4B). Podłącz adapter stożkowy Luer do 3-drogowych zaworów odcinających.
3. Dodać 2 ml 0,01% roztworu PLL za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml, która łączy się z 3-drogowym kranem wlotu pożywki (Rysunek 4B-).
4. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 3 ml do 3-kierunkowego zaworu odcinającego wylotu pożywki (Rysunek 4B-).
5. Wypełnij regiony kultur komórkowych roztworem PLL. Ręcznie powoli pompuj roztwór powlekający tam iz powrotem. Zamknij dwa 3-drogowe zawory odcinające, aby uszczelnić roztwór wewnątrz obszarów hodowli.
6. Inkubować chip MOE w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze wypełnionym 5% atmosferą_CO2
.

3. Przygotowanie sieci mostów solnych

1. Postępując zgodnie z krokiem 2.6, otwórz dwa 3-drogowe zawory odcinające i wypłucz pęcherzyki w kanałach, ręcznie pompując roztwór powlekający tam iz powrotem w kanale za pomocą dwóch strzykawek.
2. Pobrać 3 ml kompletnego podłoża (pożywki podtrzymującej komórki macierzyste składającej się ze zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych Eagle's Eagle's Medium firmy Dulbecco F-12 (DMEM/F12), 2% suplementu B-27, 20 ng/ml EGF i 20 ng/ml bFGF) do strzykawki o pojemności 3 ml, która łączy się z 3-kierunkowym zaworem odcinającym wlotu pożywki (Rysunek 4B- i Rysunek 4B- ).
3. Dodać 3 ml kompletnej pożywki, aby zastąpić roztwór powlekający w obszarach hodowli komórkowych. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 5 ml do 3-kierunkowego kranu wylotu pożywki (Rysunek 4B-).
4. Przygotuj sieć mostków solnych (rysunek 5).
   1. Przeciąć czarną gumową zatyczkę, aby zrobić szczelinę, a następnie włożyć elektrody srebra (Ag)/chlorku srebra (AgCl) przez czarną gumową zatyczkę do strzykawki Luer lock (Rysunek 4A).
   2. Zastąp białą zatyczkę dociskową adapterem Luer i wstrzyknij 3% gorącej agarozy, aby napełnić adapter Luer.
      nuta: W celu przygotowania gorącej agarozy rozpuścić 3 g proszku agarozy w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
   3. Podłączyć strzykawkę Luer lock do adaptera Luer. Wstrzyknąć 3% gorącej agarozy przez czarną gumową zatyczkę, aby napełnić strzykawkę Luer lock za pomocą strzykawki z igłą. Odczekaj od 10 do 20 minut, aż agaroza ostygnie i stężeje.
      nuta: W celu zwiększenia objętości agarozy, strzykawka Luer lock jest montowana na adapterze Luer (Rysunek 4 i Rysunek 5). Następnie duże elektrody są wprowadzane do strzykawki Luer lock. Elektroda jest w stanie zapewnić stabilną stymulację elektryczną dla długotrwałego eksperymentu.

4. Przygotowanie mNPC

1. Hodowlę mNPC w kompletnym pożywce w kolbie do hodowli komórek 25T w temperaturze 37 °C w inkubatorze wypełnionym atmosferą 5%_CO2. Subkulturuj komórki co 3-4 dni i wykonuj wszystkie eksperymenty na komórkach, które przeszły 3-8 pasaży od pierwotnego źródła.
2. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj neurosfery w temperaturze 100 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i przemyć neurosfery 1x PBS Dulbecco (DPBS). Obracaj neurosfery pod ciśnieniem 100 × g przez 5 minut.
3. Odessać 1x DPBS, a następnie ponownie zawiesić neurosfery w kompletnym pożywce. Dokładnie i delikatnie wymieszaj.
4. Dodaj 1 ml zawiesiny neurosfery za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, która łączy się z 3-drogowym zaworem odcinającym wylotu (Rysunek 4B-).

5. Konfiguracja systemu mikroprzepływowego do stymulacji impulsami prądu stałego (Rysunek 6)

1. Zainstaluj układ MOE z nasionami ogniw na przezroczystej grzałce tlenku indu i cyny (ITO), która jest przymocowana do programowalnego zmotoryzowanego stolika X-Y-Z.
   nuta: Temperatura powierzchni ITO jest kontrolowana przez regulator proporcjonalno-całkująco-pochodny i utrzymywana na poziomie 37 °C. Termopara typu K jest zaciśnięta między chipem a grzałką ITO w celu monitorowania temperatury obszarów hodowli komórkowych w chipie. Układ MOE jest zainstalowany na programowalnym zmotoryzowanym stoliku X-Y-Z i nadaje się do automatycznej akwizycji obrazu poklatkowego w poszczególnych sekcjach kanału. Produkcja grzałki ITO i konfiguracja systemu ogrzewania kultur komórkowych zostały opisane wcześniej.
2. Wlej mNPC poprzez ręczne pompowanie do chipa MOE przez wylot pożywki. Inkubować rozsiany komórkami chip MOE na grzałce ITO o temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
3. Po 4 godzinach przepompować całe medium przez chip MOE przez wlot medium z natężeniem przepływu 20 μL/h za pomocą pompy strzykawkowej.
   nuta: MNPC są hodowane i utrzymywane w chipie przez dodatkowe 24 godziny przed stymulacją polem elektrycznym (EF), aby umożliwić przyczepienie się i wzrost komórek. Niewykorzystana ciecz jest zbierana w pustej strzykawce o pojemności 5 ml podłączonej do 3-drogowego kranu wylotu, pokazanego jako "odpad" na rysunku 6A. Konfiguracja układu mikroprzepływowego MOE pokazano na rysunku 6. Ten system mikroprzepływowy zapewnia ciągłe dostarczanie składników odżywczych do komórek. Kompletna świeża pożywka jest w sposób ciągły pompowana do chipa MOE w celu utrzymania stałej wartości pH. W związku z tym komórki mogą być hodowane poza inkubatorem emisji_CO2
.
4. Użyj przewodów elektrycznych, aby podłączyć multiplekser EF do układu MOE za pomocą elektrod Ag/AgCl na chipie. Podłącz multiplekser EF i generator funkcyjny do wzmacniacza, aby wyprowadzać impulsy prądu stałego o fali prostokątnej o wielkości 300 mV/mm z częstotliwością 100 Hz przy 50% cyklach pracy (50% czasu włączenia i 50% czasu wyłączenia) (ilustracja 6B).
   1. Podłącz przewody elektryczne do multipleksera EF. Podłącz przewody elektryczne do układu MOE za pomocą elektrod Ag/AgCl.
   2. Podłącz multiplekser EF do amplifier za pomocą przewodów elektrycznych. Podłączyć generator funkcyjny do amplifier i oscyloskop cyfrowy.
      nuta: Multiplekser EF to obwód, który obejmuje impedancję komory hodowlanej w obwodzie i łączy wszystkie poszczególne komory w równoległą sieć elektroniczną. Każda z trzech komór hodowlanych jest elektrycznie połączona szeregowo z rezystorem zmiennym (Vr) i amperomierzem (pokazanym jako μA na rysunku 6A) w multiplekserze. Prąd elektryczny przepływający przez każdą komorę hodowlaną jest zmieniany przez sterowanie Vr, a prąd jest pokazany na odpowiednim amperomierzu. Natężenie pola elektrycznego w każdym regionie hodowli komórkowej obliczono za pomocą prawa Ohma, I = σEA, gdzie I to prąd elektryczny, σ (ustawione na 1,38 S·^m-1 dla DMEM/F12) to przewodność elektryczna pożywki hodowlanej, E to pole elektryczne, a A to pole przekroju poprzecznego komory elektrotaktycznej. Dla wymiaru obszaru hodowli komórkowej pokazanego na rysunku 1 prąd elektryczny wynosi ~87 mA i ~44 mA dla impulsu DC i DC odpowiednio przy 50% cyklu pracy.
5. Poddaj mNPC kwadratowym impulsom prądu stałego o wielkości 300 mV/mm z częstotliwością 100 Hz przez 48 godzin. Pompuj w sposób ciągły całe podłoże z szybkością 10 μl/h, aby zapewnić odpowiednie odżywienie komórkom i utrzymać stałą wartość pH w pożywce.

Wyniki

Ilustracja 1: szczegółowa konfiguracja wielokanałowego, optycznie przezroczystego układu elektrotaktycznego.(A) Widok rozstrzelony zespołu układu scalonego MOE. Układ MOE składa się z arkuszy PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), taśmy dwustronnej (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adapterów (10 mm x 10 mm x 6 mm), arkusza PMMA klasy optycznej (50 mm x 75 mm x 3 mm), taśmy dwustronnej (24 mm x 60 mm...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoża PMMA 1 mm (warstwy 1-3)	BHT	Zobacz materiał K2R20	Polimetakrylan metylu (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Plastikowa tubka 15 ml	Przedsiębiorstwo Technologiczne Protech Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Rurka ze stożkowym dnem i nakrętką, zmontowana, wstępnie sterylizowana
Strzykawka 3 ml	TERUMO	Rejestrator DVR-3413	Strzykawki doustne 3 ml, bez igły
3 mm PMMA klasy optycznej (warstwa 5)	Korporacja CHI MEI	Arkusz ACRYPOLY PMMA	Klasa optyczna PMMA
Kran 3-drogowy	NIPRO	NCN-3L	Sterylny jednorazowy 3-kierunkowy kran
Strzykawka 5 ml	TERUMO	Rejestrator DVR-3410	Strzykawki doustne 5 ml, bez igły
Adapter	Dong Zhong Co., Sp. z o.o.	Dostosowane	Adapter PMMA
Agarozy	Sigma-Aldrich	Nr kat. A9414	Agaroza, niska temperatura żelowania
wzmacniacz	A.A. Lab Systems Sp. z o.o	A-304	Wzmacniacz wysokiego napięcia
Oprogramowanie AutoCAD	Biurko Autodesk	Wersja edukacyjna	Opracowanie
Suplement B-27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12587-010	Suplement B-27 (50x), bez witaminy A
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Nazywany również rekombinowanym ludzkim FGF-zasadowym
Czarna gumowa zatyczka	TERUMO	Rejestrator DVR-3413	Od 3 ml strzykawek doustnych, bez igły
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B4287	Odczynnik blokujący
wirówka	HSIANGTAI powiedział:	Zobacz materiał CV2060	wirówka
Rysik laserowy CO2	Narzędzia laserowe i technika Corp.	ILS-II	Zakupione od http://www.lttcorp.com/index.htm
Łącznik stożkowy	IDEX Zdrowie i Nauka	F-120X	Jednoczęściowy stożek dociskowy 10-32, do 1/16" OD naturalny
Adapter Cone-Luer	IDEX Zdrowie i Nauka	Zobacz materiał P-659	Luer Adapter 10-32 żeński na żeński Luer, PEEK
Konfokalny mikroskop fluorescencyjny	Mikrosystemy Leica	TCS SP5 (wersja dodatkowa)	Instrukcja obsługi Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Aparat cyfrowy	Olympus	E-330	Automatyczna akwizycja zdjęć poklatkowych
Oscyloskop cyfrowy	Tektronix	TDS2024	Mierz sygnały napięcia lub prądu w czasie w obwodzie elektronicznym lub komponencie, aby wyświetlić amplitudę i częstotliwość.
Taśma dwustronna	3 mln	PET 8018 (pol	Zakupione od http://en.thd.com.tw/
Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle's Medium i szynki F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12)	Gibco (firma Gibco)	12400024	DMEM/F-12, proszek, HEPES
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco	Gibco (firma Gibco)	21600010	DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu
Multiplekser EF	Azjatyckie Niebo Co., Sp. z o.o.	Dostosowane	Monitorowanie i sterowanie prądem elektrycznym w poszczególnych kanałach
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Nazywany również rekombinowanym ludzkim EGF
Szybko działający klej cyjanoakrylowy	3 mln	Zobacz materiał 7004T	Wytrzymałość: klej błyskawiczny (płyn)
Łącznik z płaskim dnem	IDEX Zdrowie i Nauka	Zobacz materiał P-206	Nakrętka męska bez kołnierza Delrin, 1/4-28 z płaskim dnem, do 1/16" OD niebieski
Generator funkcyjny	Technologie Agilent	33120A	Wysokowydajny syntetyzowany generator funkcyjny 15 MHz z wbudowaną możliwością arbitralnego kształtu fali
Szkło indowo-cynowo-tlenkowe (ITO)	Merck	300739	Do grzałki ITO
Termopara typu K	Tecpel	TPK-02A	Termopary temperaturowe
Adapter typu luer	IDEX Zdrowie i Nauka	Zobacz materiał P618-01	Adapter Luer żeński Luer na 1/4-28 męski polipropylen
Strzykawka typu luer lock	TERUMO	Rejestrator DVR-3413	Do mostków solnych agarowych
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Podstawowe życie	BL2651	Roztwór myjący
Poli-L-lizyna (PLL)	Sigma	Zobacz materiał P4707	Roztwór do powlekania
Grubość precyzyjnych szkieł nakrywkowych nr 1,5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programowalny stopień z napędem X-Y-Z	Tanlian Inc	Dostosowane	Zakupione od http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Regulator proporcjonalno-całkująco-pochodny (PID)	Elektronika Toho	TTM-J4-R-AB	Regulator temperatury
Przewód PTFE	Professional Plastics Inc. Oddział na Tajwanie	Średnica zewnętrzna 1/16 cala	Biała półprzezroczysta rurka PTFE
Pompa strzykawkowa	Nowa Era Systems Inc	NE-1000	Programowalna pojedyncza pompa strzykawkowa NE-1000
Detergent TFD4	FRANKLAB	Płyta TFD4	Środek do czyszczenia szkła nakrywkowego
Spoiwo termiczne	Kuan-MIN Tech Co.	Dostosowane	Zakupione od http://kmtco.com.tw/
Ultradźwiękowa	Lew	LEO-300S	Ultradźwiękowy środek czyszczący
Komora próżniowa	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Sp. z o.o.	DOV-30	Suszarka próżniowa
Biała wtyczka doszczelna	IDEX Zdrowie i Nauka	Zobacz materiał P-316	1/4-28 Płaskie dno, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html