Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Koch, L. S., et al. Solidna produkcja tkanek do długoterminowej hodowli organoidów mózgowych pochodzących z iPSC do badań nad starzeniem. J. Vis. Exp. (2023).

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

Rysunek 1 ilustruje schematyczny przegląd przepływu pracy tego protokołu.

1. Przeprogramowanie i konserwacja iPSC

1. Zbierz 8 ml krwi pacjenta (w podeszłym wieku lub chorego; w wieku 65 lat i starszych) do probówek do przygotowania komórek (CPT) z cytrynianem sodu lub do kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub probówek z heparyną.
2. Wirować przy 1 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu zebrania osadu zawierającego tylko k....

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja przepływu pracy i osi czasu tej metody.

Rycina 2: Różnicowanie i dojrzewanie organoidów mózgowych. (A) Reprezentatywny obraz kultury iPSC przy zbieżności 70%-80%. (B) Wygenerowano c.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-β-merkaptoetanol	Thermo Fisher Naukowy	31350010
Chlorowodorek 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolodylodichlorowy (DAPI)	Invitrogen	Zobacz materiał D1306	67:40:00
6-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka wielodołkowa CELLSTAR do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One	657185
6-dołkowa przezroczysta, płaska płytka dołkowa z płaskim dnem	Corning	3471
96-dołkowa, przezroczysta, okrągła płytka z okrągłym dnem i bardzo niskim mocowaniem	Corning	Zobacz materiał 7007
96-dołkowa, mikropłytka z płaskim dnem poddana działaniu nunclon Delta	Thermo Fisher Naukowy	136101
Dokładności	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 46964	Rozwiązanie do odłączania komórek
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100x)	Gibco (firma Gibco)	15240062
B27 Suplementacja (z witaminą A) (50x)	Gibco (firma Gibco)	17504044
Suplement witaminy B27 (bez witaminy A) (50x)	Gibco (firma Gibco)	12587010
BD Vacutainer™ Szklane probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych (CPT)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 02-685-125
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	Nr kat. A9418
wirówka	Eppendorf	5810 R	Z uchwytami na talerze
CHIR99021	Selleck Chemikalia	Zobacz materiał S2924
Wektor przeprogramowania CytoTune Sendai	Thermo Fisher Naukowy	A1378001
Startery ddPCR | człowiek | MAPT (mapt mapt)	Bio-Rad	dHsaCPE192234
Startery ddPCR | człowiek | RBFOX3 (NeuN)	Bio-Rad	dHsaCPE5052108
DMEM/F12	Thermo Fisher Naukowy	11320074
Podwójna kortyna (DCX)	Biotechnologia Santa Cruz	SC-8066	09:20
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Naukowy	14190144	bez wapnia, bez magnezu
Kubki Eppendorf, 1,5 ml	Eppendorf	Numer katalogowy: 0030 125.215
Niezbędne 6	Gibco (firma Gibco)	A1516401
Niezbędny 8	Gibco (firma Gibco)	A1517001
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Invitrogen	15575020
Probówki Falcon, 15 mL, stożkowe	Greiner Bio-One	188271-N
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	252549	37% roztwór podstawowy, rozcieńczony do 4% w PBS
Geltrex Matryca membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu bez LDEV	Thermo Fisher Naukowy	A1413202
GlutaMax (100x)	Gibco (firma Gibco)	35050038
Licznik komórek hemektometru	Naukowy Hausser	Rok 1490
Bufor HEPES	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15-630-080
insulina	Sigma-Aldrich	I9278
LDN 193189	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 72147
MAP2	Księga Abcam	ab32454	04:20
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca błony podstawnej, wolna od LDEV	Corning	Numer katalogowy: 356230	matryca membrany podstawnej
MEM-Endogenny roztwór aminokwasowy (MEM-NEAA; 100x)	Thermo Fisher Naukowy	11140050
Licznik Multilabel Victor 3 Czytnik płyt	Perkin Elmer	1420	luminometr
Zestaw do wykrywania MycoAlert MycoAlert	Lonza	LT07-318
Suplement N-2 (100x)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 17502-048
NeuN	Milipory	MAB377 powiedział	09:20
Podłoże nerwowo-podstawowe	Thermo Fisher Naukowy	21103049
Przeciwciało Oct-3/4 (C-10) Alexa Fluor 647	Biotechnologia Santa Cruz	SC-5279 AF647	02:40
Parafilm	Bemis	PM-996 (wersja angielska)	arkusz folii termoplastycznej
PAX6 (wersja	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 42-6600	04:20
Penicylina/Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15070063
Mikrofilamenty poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA)	Etyka	Zobacz materiał J463
Cyfrowy system PCR QX200 z kroplami	Bio-Rad	1864001
Inhibitor ROCK (Y27632)	Selleck Chemikalia	Zobacz materiał S1049
SB431542	Systemy badawczo-rozwojowe	nr kat. 1614/50
Przeciwciało monoklonalne SOX2 (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience	Invitrogen	Tel. 53-9811-80	02:40
Synapsyna I (SYN)	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	574777	04:20
Tryton-X 100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787
TUJ1	Biotechnologia Santa Cruz	SC-80005	Beta-3-tubulina; 1:500
XAV939	Tocris Bioscience	Numer katalogowy: 3748

SZT. TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: szt. : powiedział: główna) TGL TGL TGL powiedział: powiedział: