$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
Rysunek 1 ilustruje schematyczny przegląd przepływu pracy tego protokołu.
1. Przeprogramowanie i konserwacja iPSC
- Zbierz 8 ml krwi pacjenta (w podeszłym wieku lub chorego; w wieku 65 lat i starszych) do probówek do przygotowania komórek (CPT) z cytrynianem sodu lub do kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub probówek z heparyną.
- Wirować przy 1 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu zebrania osadu zawierającego tylko krew obwodową i bez surowicy.
- W celu uzyskania iPSC należy użyć specjalistycznych wektorów przeprogramowania zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów).
- Hodowla iPSC na wolnych od dehydrogenazy laktozowej, wolnych od dehydrogenazy laktozy wirusie udźwigu (LDEV), pokrytych matrycą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, na 6-dołkowych płytkach hodowlanych w pożywce Essential 8 (E8) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
- Utrzymuj iPSC w pożywce E8 przez 3-4 dni, aby uniknąć przepełnienia lub spontanicznego różnicowania.
- Zwaliduj pluripotencję linii iPSC za pomocą markerów immunofluorescencyjnych (krok 2) i przetestuj na obecność mykoplazmy (krok 3).
2. Barwienie pluripotencji
- Aby zachować roztwory i przeciwciała, należy wysiać komórki na powlekanych (krok 1.4) 24-dołkowych płytkach hodowlanych 3-4 dni przed analizą. Odessać pożywkę pipetą i utrwalić komórki 4% formaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (1x PBS) przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć komórki 3x 1x PBS i przepuścić 0,1% Triton-X 100 w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez co najmniej 15 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę w RT.
- Umyć 3x 1x PBS i blokować 5% BSA w PBS przez 30 min w RT.
- Przemyć ponownie 3x 1x PBS i dodać przeciwciała Sox2 i Oct3/4 (rozcieńczenie 1:100; patrz Tabela Materiałów) oraz barwienie nukleinowe DAPI w 1% BSA (rozcieńczenie 1:4,000) przez noc w temperaturze 4 °C. Zawiń w folię aluminiową, aby chronić przed światłem.
- Umyj 3x 1x PBS i pozostaw komórki w PBS. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym w powiększeniu 10-20x. Upewnij się, że markery pluripotencji, region Y-box 2 determinujący płeć (Sox2) i czynnik transkrypcyjny wiążący oktamer 3/4 (Oct3/4) są zlokalizowane w jądrach komórek.
3. Badanie na obecność mykoplazmy
UWAGA: Zapoznaj się z protokołem zestawu do wykrywania (zobacz Tabelę materiałów), aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonywania testów i etapów analizy. Zestaw do wykrywania zapewnia odczynnik, substrat i bufor testowy do testowania mykoplazmy.
- Przed pasażowaniem komórek lub odświeżaniem należy zebrać 2-3 ml pożywki do hodowli komórkowych w probówce wirówkowej i granulować wszelkie komórki lub zanieczyszczenia w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C przez ≤5 dni. Inkubować komórki z pożywką przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić wykrywalny sygnał.
- Dodać 100 μl supernatantu komórkowego do świeżej probówki lub dołka 96-dołkowej płytki o białych ściankach (zalecane nieprzezroczyste dno, patrz Tabela materiałów). Odczynnik i substrat należy rozpuścić w buforze do oznaczania i równoważyć przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 100 μl odczynnika do próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru (pomiar #1).
- Dodać 100 μl substratu do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć luminescencję (pomiar #2).
- Określ zanieczyszczenie mykoplazmą przez stosunek pomiaru #2 do #1. Zapoznaj się z instrukcją zestawu w celu interpretacji wyników.
4. Przygotowanie mikrofilamentu
- Przygotowanie mikrowłókien poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA, patrz Tabela materiałów) należy rozpocząć od postrzępienia pasma szwu końcem skalpela. Lekko spryskaj postrzępione włókno 70% etanolem.
- Pod mikroskopem i za pomocą linijki zacznij ciąć włókno PLGA na fragmenty pasm o długości od 500 μm do 1 mm. Wytnij w sumie około 25 mm włókna. Przechowuj filamenty w probówce o pojemności 15 ml z 1 ml roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
- W kapturze rozcieńczyć roztwór błonnika 10 ml DMEM/F-12 (Tabela 1). Dobrze wymieszaj roztwór.
nuta: Praca w okapie przepływowym do hodowli komórkowych w sterylnym środowisku.
- Dodać 20 μl roztworu błonnika do trzech dołków tworzących ciało zarodka (EB) na 96-dołkowej płytce. Pod mikroskopią jasnego pola policz i uśrednij włókna na studzienkę. Rozcieńczyć lub skoncentrować średnio 5-10 mikrofilamentów PLGA na dołek. Przygotuj każdą studzienkę w ten sposób.
- Studnie są teraz gotowe do zasiania komórkami. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej do czasu jej użycia lub w temperaturze 4 °C przez następny dzień.
5. Formowanie się ciała zarodkowego (EB)
UWAGA: Wszystkie media i roztwory muszą być podgrzane do RT.
- Gdy iPSC osiągną konfluencję 70%-80% (ryc. 2A), są gotowe do przejścia i wykorzystania do tworzenia EB. Sprawdź komórki pod mikroskopem w powiększeniu 10x-20x. Upewnij się, że kolonie wykazują minimalne (<10%) obszary spontanicznego różnicowania.
- Odessać pożywkę pipetą i raz umyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Oddzielić kolonie przez dodanie 500 μl roztworu do odrywania komórek (patrz tabela materiałów) lub 0,5 mM EDTA i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
nuta: Praca w okapie przepływowym do hodowli komórkowych w sterylnym środowisku.
- Zebrać uwolnione komórki, dodając 1 ml świeżej pożywki E8 do każdego dołka i delikatnie pipetować, aż wszystkie komórki zostaną odłączone.
- Przenieś 1,5 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodaj kolejny 1 ml świeżej pożywki E8, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 ml.
- Wirować przy 290 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant za pomocą pipety, zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki Essential 6 (E6, patrz tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 50 μM kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
- Przygotować zawiesinę komórkową 60 000-90 000 komórek/ml, w zależności od pożądanej gęstości wysiewu, w pożywce E6 uzupełnionej 50 μM inhibitora ROCK (patrz tabela materiałów).
- Dodać 150 μl zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu (ULA) (lub przygotowanej płytki wklęsłej). Wysiewaj 9 000-11 000 komórek na dołek.
- Odwirować płytkę w celu wymuszonej agregacji komórek przy 290 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2.
6. Indukcja neuroepitelialna
- Po 24 godzinach ostrożnie odessać pipetą 120 μl pożywki. Upewnij się, że nie zasysasz EB, opuszczając końcówkę pipety zbyt głęboko do studzienki.
- Dodać 150 μL pożywki E6 (w temperaturze pokojowej) uzupełnionej 2 μM XAV939 i supresorem matek przeciwko inhibitorom dekapentaplegii (SMAD): 10 μM SB431542 i 500 nM LDN 193189 na studzienkę (patrz Tabela materiałów).
- Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżo przygotowane pożywki E6 uzupełnione 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 i 500 nM LDN 193189,
nuta: Do 6 dnia (DIV6) EB powinny mieć średnicę 550-600 μm i być gotowe do dalszego różnicowania.
7. Różnicowanie i dojrzewanie organoidów
UWAGA: Wszystkie media muszą być podgrzane do RT.
- Około DIV7 sprawdź, czy wszystkie EB osiągnęły średnicę 550-600 μm i wykazują gładką i wyraźną krawędź (rysunek 2B); na tym etapie są gotowe do osadzenia w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
nuta: Praca w sterylnym środowisku.
- Przygotuj wgłębienia w arkusze do zatapiania z termoplastycznej folii uszczelniającej (patrz Tabela materiałów), umieszczając arkusz folii (o długości około 4 cali) na pustym pudełku P200. Używając stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub probówki mikrowirówkowej o pojemności 500 μl, delikatnie dociśnij arkusz folii do otworów, aby wykonać 12 wgłębień. Spryskaj arkusz folii 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia w okapie przepływowym przy włączonym świetle UV na co najmniej 30 minut.
- Rozmrozić wystarczającą ilość matrycy membrany podstawnej (Matrigel, patrz Tabela Materiałów) na lodzie i umieścić ją w okapie przepływowym.
nuta: Na EB potrzeba około 30 μl nierozcieńczonej matrycy membranowej. Matrycę membrany należy zawsze utrzymywać w temperaturze poniżej 4 °C, aby zapobiec jej zżelowaniu. Zalecane są również wstępnie schłodzone końcówki do pipet, ponieważ spowalniają one polimeryzację matrycy w końcówce podczas pipetowania, zmniejszając w ten sposób straty materiału.
- Używając końcówki P200 o szerokim otworze, przenieś jeden EB do każdego wgłębienia i usuń jak najwięcej pożywki za pomocą zwykłej końcówki do pipety. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia EB. Używając zwykłej końcówki P200, dodaj ~30 μl nierozcieńczonej matrycy membranowej do każdego organoidu, upewniając się, że EB znajduje się w środku kropli.
- Gdy wszystkie EB zostaną osadzone w matrycy, umieść arkusz filmu zawierający EB na sterylnej szalce Petriego.
nuta: Opcjonalnie małą szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą można umieścić na większej szalce Petriego obok arkusza folii, aby zapobiec parowaniu.
- Przenieść naczynie do inkubatora i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez około 10 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy membranowej.
- Dla każdego zestawu 12 osadzonych organoidów należy przygotować 5 ml pożywki różnicującej z witaminą B27 bez witaminy A (Tabela 1) w jednym dołku 6-dołkowej płytki ULA. Podgrzej płytkę do temperatury 37 °C w inkubatorze.
- Po zakończeniu czasu inkubacji przenieś osadzone EB na 6-dołkową płytkę ULA, biorąc arkusz folii i wypychając wgłębienia z tyłu arkusza. W razie potrzeby weź 1 ml z dołka i odpipetuj go na arkusz, aby kropelki oderwały się od folii.
nuta: Ważne zmiany morfologiczne można zaobserwować 1 dzień po osadzeniu; EB przechodzą od gładkich krawędzi do wybrzuszonych wypukłości tworzących pąki (ryc. 2C).
- Po 2 dniach (DIV9) wykonaj wymianę pożywki o połowę. Należy uważać, aby nie zassać ani nie uszkodzić kropelek matrycy membrany w tym procesie.
- Po kolejnych 2 dniach (DIV11) należy przeprowadzić pełną wymianę pożywki, uzupełniając pożywkę o 3 μM CHIR99021 (patrz Tabela Materiałów).
- W DIV14 zmień pożywkę na pożywkę różnicującą z witaminą B27 z witaminą A (Tabela 1) w celu stopniowego zwiększania wielkości organoidów.
- Przy DIV16 umieść płytkę studzienkową na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 90 obr./min wewnątrz inkubatora. Zmieniaj nośnik co 2 dni.
- Co 40 działek rozcieńczyć 500 μl matrycy membranowej na każde 50 ml pożywki, aby uzyskać dodatkowe składniki odżywcze w pożywce.
Tabela 1: Skład mediów różnicujących użytych w niniejszym badaniu.
| Odczynnik | Stężenie końcowe | Objętość (łącznie 50 ml) |
| Zobacz materiał DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Podłoże nerwowo-podstawowe | 50% | 25 ml |
| Suplement N2 (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Suplement -/+ Witamina A (50x) | 0,5 razy | 0,5 ml |
| insulina | 0.25% | 12,5 μl |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5 razy | 0,25 ml |
| HEPESY (1 m) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antybiotyk/Antybiotyk (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-merkaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| UWAGA: niektóre DMEM-F12 już zawierają GlutaMAX, nie ma potrzeby dodawania dodatkowego. |
