$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Sekcja zarodków i dysocjacja tkanek
- Dorosłe samice szczurów (200-250 g) trzymane są w pomieszczeniach dla zwierząt w stałej temperaturze (22 ± 1 °C) i wilgotności względnej (50%) w regularnym harmonogramie jasno-ciemnym (światło 7–19). Upewnij się, że jedzenie i woda są swobodnie dostępne.
- Znieczulenie ciężarnej samicy szczura po 18 dniach rozwoju (E18) za pomocą 3% izofluranu. Następnie złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Usuń hipokampy z każdego zarodka szczura i umieść je w lodowatym roztworze soli Hanka bez Ca2+ i Mg2+. W 18 dniu rozwoju tkanki hipokampa i kory mózgowej są bardzo miękkie i nie trzeba ich kroić na małe kawałki. Więcej szczegółów można znaleźć tutaj.
- Zdysocjuj tkankę w 0,125% roztworze trypsyny/Hanka zawierającym 0,05% DNAzy przez 18-20 minut w temperaturze 37 °C.
- Usunąć roztwór sklarowany nad osadem za pomocą pipety Pasteura i zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodając pożywkę z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na 5 minut.
- Usuń pożywkę za pomocą FBS i przemyj raz pożywką z jej suplementem, 1% L-glutaminy, gentamycyna 10 μg/ml. Usuń ponownie pożywkę za pomocą pipety Pasteura i ponownie napełnij ją niewielką ilością (500 μl) pożywki wzrostowej z jej suplementem, 1% L-glutaminy, gentamycyną 10 μg/ml.
- Oddzielić osad tkankowy mechanicznie za pomocą wąskiej pipety Pasteura, aż do uzyskania mlecznej zawiesiny komórek. Nie ma potrzeby odwirowywania zawiesiny komórek.
- Rozcieńczyć małą objętość zawiesiny komórkowej pożywką wzrostową, aby uzyskać końcową objętość 2,0 ml. Policz uzyskane stężenie komórkowe za pomocą komory hemocytometru. Rozcieńczyć to stężenie w stosunku 1:5 w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek 600-700 komórek/μl.
2. Poszycie komórek
- Płytki komórkowe o gęstości około 2,000 komórek/mm2 na obszarze aktywnym MEA, zdefiniowanym przez ograniczenie PDMS do stworzenia sieci neuronalnej 2D.
nuta: Każdy hipokamp zawiera około 5 x 105 komórek (1 x 106 dla pojedynczego zarodka). Wypreparuj 6 zarodków, aby uzyskać łączną ilość 6 x 106 komórek w 2 ml i szacowane stężenie 3,000 komórek/μl. Rozcieńczyć to stężenie w stosunku 1:5 w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek i płytki około 600-700 komórek/μl. Jeśli obszar MEA ograniczony ograniczeniem PDMS wynosi około 7,065mm2, a całkowita liczba posianych komórek 600 komórek/μl x 24 μl = 14 400 komórek, końcowa gęstość wynosi 2,038 komórek/mm2.
- Umieścić urządzenia MEA w inkubatorze z nawilżoną atmosferą CO2 (5%) w temperaturze 37 °C.
- Rozprowadzić 160 μl zawiesiny o stężeniu komórek 600-700 komórek/μl (około 100 000 komórek) na powierzchnię monowarstwy mikrogranulek umieszczonej wewnątrz płytek wielodołkowych, aby zakończyć wstępny etap budowy hodowli trójwymiarowej. Umieścić płytki wielodołkowe w inkubatorze z wilgotną atmosferą CO2 (5%) w temperaturze 37 °C.
>3. 3D Budowa sieci neuronowej
- 6-8 godzin po posiewie bardzo ostrożnie przenieść zawiesinę (mikrogranulki z neuronami) z płytek wielodołkowych do obszaru ograniczonego ograniczeniem PDMS za pomocą zestawu pipet na objętość około 30-40 μl. Po każdym przeniesieniu odczekaj około pół minuty, aby mikrogranulki mogły się samozorganizować w sześciokątną, zwartą strukturę.
- Gdy wszystkie warstwy zostaną osadzone i spontanicznie złożone, ponownie napełnij dużą kroplą około 300 μl podłoża w górnej części obszaru ograniczonego ograniczeniem PDMS.
- Umieść strukturę 3D sprzężoną z MEA w inkubatorze (T = 37,0 °C, CO2 = 5%) na 48 godzin przed dodaniem końcowej objętości (około 1 ml) kultury pożywki wzrostowej z jej suplementem.
nuta: Weź pod uwagę całkowitą liczbę koralików na płytkach wielodołkowych z wkładką membranową (30 000) oraz liczbę koralików na pojedynczej warstwie na urządzeniu MEA (6 000). Powstała struktura 3D składa się z 5 warstw mikrogranulek i komórek. Biorąc pod uwagę, że sieć neuronalna 3D nie jest geometrycznie doskonała, powstała struktura 3D może składać się z 5-8 warstw.
- Następnego dnia po posiewie ostrożnie dodać końcową objętość pożywki (około 900 μl) do pierścienia MEA. Utrzymuj kultury 3D w wilgotnej atmosferze CO2 (5%) w temperaturze 37 °C przez 4-5 tygodni. Wymieniaj połowę podłoża raz w tygodniu.