Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie i hodowla astrocytów korowych
UWAGA: Wykonaj te kroki protokołu co najmniej 7 dni przed przejściem do następnych kroków, ponieważ kultury astrocytów powinny przekształcić się w zlewające się monowarstwy zanim neurony zostaną przygotowane. Astrocyty pierwotne pochodzą z mieszanych kultur glejowych uzyskanych od młodych myszy około dnia pourodzeniowego (P) 0-3. Na każdą kolbę T75 należy użyć trzech mózgów (6 kory) do zainstalowania zębów.
- Przygotuj pożywkę astrocytów, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) 10% v/v surowicy końskiej i 0,1% v/v gentamycyny w sterylnych warunkach. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
- Pokryć 3 kolby T75 10 μg/ml poli-D-lizyny (PDL; w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 6% v/v CO2 . Po pokryciu należy dwukrotnie przemyć kolby solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia niezwiązanych kationów i dodać 9 ml pożywki astrocytowej.
- Aby przygotować mózgi, dodaj 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do 1x 10 cm szalki Petriego i 1 ml HBSS do 1x 15 ml probówki (niezależnie od liczby mózgów, które zostaną użyte). Trzymaj w zasięgu ręki nożyczki chirurgiczne, 2 cienkie kleszcze i lornetkę podczas zabiegu.
- Szybko odetnij 3 szczenięta nożyczkami chirurgicznymi i zbierz głowy do pustego 10-centymetrowego naczynia.
- Wykonaj przygotowanie kory mózgowej pod lornetką. Za pomocą dwóch cienkich kleszczy usuń skórę grzbietową z czaszki w linii środkowej, zaczynając od szyi w górę w kierunku poziomu oczu. Następnie mózg z naczyniami krwionośnymi jest widoczny pod czaszką.
- Przymocuj głowę na końcu rostralnym za pomocą kleszczy i naciąć linię środkową czaszki, zaczynając od tylnego końca. Następnie odetnij prawą i lewą połowę czaszki, aby odsłonić mózg.
- Zamknij końcówkę kleszczy i umieść ją brzusznie pod mózgiem. Wyjmij mózg z czaszki i przenieś go na wypełnioną HBSS 10-centymetrową szalkę Petriego. Postępuj w ten sam sposób z pozostałą próbką, aż wszystkie mózgi zostaną zebrane w naczyniu.
- Po zebraniu mózgów zacznij od oddzielenia kory mózgowia, ściskając tyłomózgowie za pomocą kleszczy, takich jak nożyczki. Wykonaj nacięcie w linii środkowej między dwiema półkulami za pomocą jednej pary kleszczy. Ostrożnie przymocuj mózg kleszczami i odetnij śródmózgowie i opuszki węchowe za pomocą drugiego kleszcza, aby uzyskać połówki kory mózgowej.
- Przymocuj jedną połowę kory mózgowej za pomocą jednej pary kleszczy i oderwij opony mózgowe od półkul, odrywając je od bocznej krawędzi, a następnie wyciągając je z powierzchni kory za pomocą drugich kleszczy.
- Odwróć połowę kory mózgowej z powierzchnią skierowaną w dół w kierunku naczynia; ostrożnie wypreparuj i usuń hipokamp w kształcie półksiężyca za pomocą jednej pary kleszczy. Przenieś pojedyncze kory do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą jednego zamkniętego kleszcza do przenoszenia pojedynczej kory.
- Po zebraniu całej kory należy przejść do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i rozpocząć przygotowania do dysocjacji tkanki korowej.
- Dodaj 1 ml DMEM do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml i dodaj 0,1% w/v papainy (30 jednostek). Inkubować zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C aż do uzyskania oczyszczonego roztworu (około 3 min). Dodać 0,24 mg/ml L-cysteiny i 20 μg/ml DNAzy i delikatnie wstrząsnąć.
UWAGA: Do trawienia potrzeba około 1 ml roztworu enzymatycznego.
- Przefiltrować (wielkość porów 0,22 μm), aby uzyskać 1 ml sterylnego roztworu przed dodaniem go do tkanki korowej. Inkubować probówki przez 30 minut - 1 godzinę w temperaturze 37 °C (tj. w łaźni wodnej).
UWAGA: Kroki 1.11 - 1.14 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 15 minut.
- Aby zakończyć reakcję trawienia, dodaj 1 ml pożywki astrocytów i ostrożnie rozdrobnij strawioną tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. W celu roztarcia delikatnie przesunąć tłok pipety, zasysając w ten sposób i wytłaczając zawiesinę tkanki korowej.
- Po dysocjacji tkanki do zawiesiny jednokomórkowej dodać 5 ml pożywki astrocytowej i wirować przez 5 minut przy 216 x g.
- Ostrożnie odessać supernatant z powstałego osadu i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki astrocytowej.
- Dodać zawiesiny komórkowe do kolb T75 uzupełnionych 9 ml pożywki astrocytów (patrz 1.2).
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w obecności 6% v/v CO2 . Po 4 dniach należy przeprowadzić pierwszą pełną wymianę podłoża (10 ml). Następnie zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.
- Po 7 dniach sprawdź, czy komórki utworzyły zlewającą się monowarstwę. Jeśli nie, poczekaj kolejne 2 - 3 dni, aż zostanie osiągnięte całkowite zlanie się kultury.
UWAGA: Astrocyty mają duże, spłaszczone ciała komórkowe, lokalizują się na dnie kolby i nie rozwijają zauważalnych procesów komórkowych. Różnią się one od małych jasnych komórek progenitorowych z kontrastem fazowym i mikrogleju znajdującego się na wierzchu monowarstwy.
- W celu pozbycia się komórek progenitorowych i uzyskania czystej kultury astrocytów, należy umieścić kolby T75 na wytrząsarce orbitalnej i wstrząsnąć kulturami O/N z prędkością 250 obr./min. Upewnić się, że temperatura jest ustawiona na 37 °C i że filtr kolby jest uszczelniony folią laboratoryjną w celu zapobieżenia parowaniu CO2 .
- Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 μM cytozyno-1-β-D-arabinofuranozydu (AraC) w celu wyeliminowania resztek dzielących się komórek.
UWAGA: inkubacja z AraC przez 2 - 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2 da w wyniku czystą hodowlę astrocytów.
- Monitoruj czystość kultur astrocytów poprzez oględziny pod mikroskopem świetlnym. Jeśli resztkowe jasne komórki progenitorowe z kontrastem fazowym i mikroglej nadal znajdują się na wierzchu monowarstwy astrocytów (patrz krok 1.16), powtórz kroki 1.18 i 1.19.
UWAGA: Zlewające się i czyste monowarstwy astrocytów można utrzymywać do 14 dni w inkubatorze (37 °C, 6% v/v CO2) przed przejściem do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni. Nie zbieraj, nie zamrażaj i nie rozmrażaj astrocytów, ponieważ komórki te stracą swoje właściwości neuronalne w wyniku procedury przechowywania.
2. Przygotowanie astrocytów do kokultury pośredniej
UWAGA: 48 - 72 godziny przed przygotowaniem neuronów, przenieś astrocyty do wkładek do hodowli komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, pojedyncza kolba T75 dostarcza wystarczającą liczbę komórek, aby podtrzymać kultury neuronalne uzyskane za pomocą jednego preparatu.
- Umieść tyle wkładek, ile potrzeba, w płytkach 24-dołkowych. Pokryj każdą wkładkę 10 μg/ml PDL (rozpuszczonym w wodzie do hodowli komórkowych) przez około 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 . Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć wkładki PBS. W międzyczasie przystąp do przygotowania astrocytów.
UWAGA: Wkładki wypełnione PBS można przechowywać do momentu, gdy zawiesina komórek astrocytów będzie gotowa do użycia.
- Odessać pożywkę astrocytów (za pomocą AraC) i przemyć kulturę jednorazowo 10 ml PBS, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości surowicy zostały usunięte.
- Dodać 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) do kolb i inkubować komórki do trypsynizacji w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 przez około 10 minut.
- Kontroluj odrywanie komórek poprzez oględziny za pomocą mikroskopu i ułatwiaj odłączanie komórek, stukając bokiem kolb o pulpit.
UWAGA: Kroki 2.5 - 2.8 są krytyczne i powinny zostać zakończone w ciągu 15 - 20 minut.
- Po trypsynizacji delikatnie ponownie zawiesić komórki w pożywce astrocytów o pojemności 7 ml i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 216 x g.
- Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki dla astrocytów.
- Policz komórki za pomocą komory liczącej.
- Wypełnij dno studzienek 24-dołkowej płytki 500 μl pożywki astrocytowej i przenieś 25 000 komórek z 500 μl pożywki astrocytowej do każdej pojedynczej wkładki. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2.
UWAGA: Po 42 - 72 godzinach kultury osiągną około 100% zbieżności. Na tym etapie czystość kultury można zweryfikować za pomocą immunocytochemii. Zlewające się kultury można utrzymywać do 7 dni, aż do przejścia do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni.
3. Przygotowanie pierwotnych neuronów hipokampa
UWAGA: Pierwotne neurony hipokampa myszy powinny pochodzić z zarodków E15.5 - E16 ciężarnych myszy.
- Przygotować pożywkę neuronową (MEM z 10 mM pirogronianu sodu, 0,1% w/v albuminy jaja kurzego, 2% v/v suplementu B27 i 0,1% v/v gentamycyny (sterylnie przefiltrowana)) i pożywkę przygotowawczą (HBSS z 0,6% w/v glukozy i 10mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowy)). Wstępnie ogrzać i wstępnie zrównoważyć pożywkę neuronową w kolbach filtracyjnych w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 .
- Umieścić szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 12 mm) w dołkach na płytkach 24-dołkowych (użyć specjalnych szkiełek nakrywkowych, które są nacięte do stosowania z wkładkami do hodowli komórkowych).
- Pokryć przez co najmniej 1 godzinę 15 μg/ml poli-DL-ornityny w wodzie (klasy hodowli komórkowej) w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 500 μl na studzienkę, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie pokryte. Umyj studzienki dwukrotnie PBS. Pozostaw PBS w studzienkach do czasu posiewu komórek. Upewnij się, że studzienki nie wyschną.
- Aby wypreparować hipokampy, przygotuj 3 naczynia o średnicy 10 cm wypełnione pożywką i 1 x probówkę o pojemności 2 ml z 1 ml pożywki do przygotowywania pokarmu. Przygotuj nożyczki i 2 cienkie kleszcze.
- Poświęć ciężarną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, wysterylizuj brzuch, myjąc go 70% v/v etanolem i otwórz brzuch ostrymi nożyczkami. Ostrożnie wyciąć paciorkę nożyczkami i przenieść narząd do naczynia o wymiarach 1x 10 cm wypełnionego podłożem do przygotowywania.
- Następnie usuń zarodki z macicy. Ostrożnie naciąć macicę i usunąć owodnię bez uszkadzania zarodków za pomocą 2 kleszczy. Następnie odetnij głowę każdemu zarodkowi nożyczkami i przenieś główki do drugiego 10-centymetrowego naczynia wyposażonego w pożywkę do przygotowania.
- Przystąpić do przygotowania głów (podobnie jak w przypadku preparatu opisanego w 1.4 - 1.7).
- Unieruchomić głowę kleszczami i naciąć czaszkę i skórę w okolicy szyi w pobliżu tyłomózgowia, prostopadle do neuraksji. Użyj drugiej pary kleszczy, aby podnieść zarówno czaszkę, jak i zakrywającą skórę, a następnie zegnij miękką nasadkę czaszki w kierunku rostralnego końca głowy, odsłaniając w ten sposób mózg.
- Za pomocą 2 kleszczy odłącz mózg od jamy czaszki. Aby to zrobić, zamknij 1 parę kleszczy i oddziel mózg od czaszki, zaczynając od opuszki węchowej i przesuwając się w kierunku tyłomózgowia. Zbierz mózgi do innego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego podłożem do przygotowywania.
- Wypreparuj hipokampy z ugrupowań kory mózgowej, jak opisano powyżej, aby przygotować astrocyty (krok 1.6). Usuń hipokampy z każdej półkuli i zbierz je do probówki o pojemności 2 ml wypełnionej pożywką.
- Po zakończeniu sekcji należy przenieść probówkę do sterylnej ławy laminarnej i wytrawić tkankę hipokampa za pomocą 1 ml roztworu trawiącego zawierającego papainę. Przygotuj roztwór wytrawiający zgodnie z opisem w krokach 1.9 - 1.10, ale zamiast tego użyj MEM DMEM.
UWAGA: Kroki 3.9 - 3.12 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 10 - 15 minut.
- Po zakończeniu trawienia ostrożnie pobrać roztwór wytrawiający, delikatnie odsysając pipetą.
- Przemyj hipokampy 3 razy pożywką neuronową, dodając kolejno, a następnie ostrożnie odsysając 1 ml świeżej pożywki hodowlanej na cykl mycia. Nie należy odwirowywać zawiesiny komórek.
- Po ostatnim etapie płukania ostrożnie rozetrzeć tkankę w 1 ml pożywki neuronowej.
- Policz komórki za pomocą komory liczącej i umieść 35 000 komórek w pożywce neuronowej o pojemności 500 μl na pojedynczy dołek na płytce 24-dołkowej (płytka wspomniana w 3.2).
UWAGA: Opcjonalnie podwielokrotność komórki może być barwiona przeciwstawnie błękitem trypanowym w celu oceny żywotności preparatu komórkowego. Kontroluj gęstość posiewu poprzez oględziny za pomocą mikroskopu (zwykle 90 - 110 komórek na pole widzenia standardowego obiektywu 10X).
- Umieścić neurony w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 przez 1 godzinę.
- Po inkubacji wyjąć przygotowane wkładki (wysiane zlewającymi się monowarstwami astrocytów) z inkubatora (patrz krok 2.8). Wymień pożywkę, odsysając pożywkę astrocytów i zastępując ją 500 μl świeżej pożywki neuronowej.
UWAGA: Wkładki powinny zawierać zlewające się monowarstwy astrocytów po 2 - 3 DIV (Days In Vitro).
- Ostrożnie umieść wstawki z astrocytami w studzienkach zawierających kultury neuronów (krok 3.13) za pomocą sterylnych kleszczy.
- Otrzymaną pośrednią kokulturę neuronów i astrocytów umieścić z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2,
UWAGA: W tych warunkach neurony mogą być hodowane przez okres do 4 tygodni w całkowicie zdefiniowanym pożywce. Nie jest konieczna żadna zmiana medium. W przypadku długotrwałych hodowli zaleca się napełnianie pustych studzienek sterylną wodą w celu zmniejszenia parowania z płytki 24-dołkowej.
