Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Sekcja mózgu szczura lub myszy
UWAGA: Można używać zarówno myszy, jak i szczurów. Zwierzęta starsze niż P8 mogą być również wykorzystywane (testowaliśmy do P12), ale usunięcie opon mózgowych będzie coraz trudniejsze. Co więcej, wydajność i zdrowie komórek będą się zmniejszać, ponieważ komórki mózgowe starszych zwierząt utworzą skomplikowane procesy i połączenia, które mogą zostać przerwane podczas dysocjacji tkanek, prowadząc do zwiększonej śmierci komórek. Opisano tutaj preparaty korowe, ale można również wykorzystać inne obszary mózgu.
- Umieścić 0,05% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Eutanazja zwierząt (ciężarnych szczurów w przypadku szczeniąt E19 lub zwierząt P0-P8) poprzez powolne zwiększanie stężenia CO2 i izolowanie mózgów. Poniższe kroki wymagają sterylnej techniki.
- Jeśli pracujesz z tkanką embrionalną, najpierw usuń zarodki z macicy i otwórz woreczki embrionalne, a następnie natychmiast odetnij głowy nożyczkami. Po odcięciu wszystkich głów przenieś je do wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego.
- Gdy głowy zostaną zanurzone w podłożu, otwórz skórę i czaszkę (obie są bardzo miękkie u młodych zwierząt) za pomocą kleszczy i uszczypnij móżdżek. Ostrożnie podnieś resztę mózgu do góry i wyjmij z czaszki.
nuta: Dwa do czterech zarodków E19 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych posianych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.
- W przypadku nowonarodzonych lub starszych szczeniąt odetnij głowy nożyczkami i odizoluj mózg, przyśrodkowo przecinając skórę w linii prostej od tyłu głowy do czubka nosa. Odciągnij skórę na bok i ostrożnie przetnij czaszkę w lewo i w prawo, a następnie podnieś kość czaszki do góry. Odetnij móżdżek i wyciągnij resztę mózgu do góry i na zewnątrz czaszki.
nuta: Dwa do trzech szczeniąt P0-P8 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych pokrytych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.
- Oddziel korę od leżącej poniżej struktury śródmózgowia. Umieść kleszcze w podłużnej szczelinie między półkulami, a następnie przesuń kleszcze między korą a strukturami śródmózgowia jednej półkuli (prostopadle do szczeliny podłużnej), aby uwolnić każdą półkulę.
- Za pomocą kleszczy usuń wszystkie opony mózgowe z każdej półkuli (i jej hipokampa), a następnie oddziel hipokampy. Jeśli wymagane są astrocyty hipokampa, przenieś każdy hipokamp do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 14 ml pożywki preparacyjnej na lodzie.
- Usuń kolejne obszary z kory każdej półkuli, jeśli wymagane są określone regiony (np. kora czołowa). Pokrój dowolną tkankę korową, która ma być użyta do wytworzenia astrocytów, na kawałki nie większe niż 1 mm3. Zebrać wszystkie kawałki tkanki korowej w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej pożywką do preparowania na lodzie.
2. Trawienie i dysocjacja tkanek
- Po zebraniu wszystkich kawałków tkanki poczekaj, aż osiądą na dnie probówki, a następnie odessaj jak najwięcej pożywki.
- Dodać 2-3 ml 0,05% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej i inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
nuta: Szybko uwolnij całą trypsynę-EDTA z pipety, aby wymieszać kawałki tkanki i pozwolić im ponownie się osadzić.
- Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, pozostawiając kawałki tkanek w jak najmniejszej ilości płynu na dnie probówki.
- Dodaj 5 ml wstępnie schłodzonej pożywki preparyjnej, aby zmyć pozostałą trypsynę-EDTA. Odpipetować z boku górnej części probówki, aby uzyskać wymieszanie kawałków tkanki.
- Odessać podłoże preparacyjne i pozostawić kawałki tkanki w jak najmniejszej ilości płynu. Powtórz ten etap mycia z użyciem wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego jeszcze dwa razy.
- Po ostatnim etapie mycia dodaj 1 ml DMEM+ (podgrzanego do temperatury pokojowej) za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i rozcieraj tkankę, pipetując w górę iw dół bez wprowadzania pęcherzyków.
nuta: Ważne jest, aby unikać wytwarzania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu, na które astrocyty są dość wrażliwe.
- Umieść sitko o pojemności 100 μm w otworze probówki o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtr 4.5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+.
- Odpipetować 1 ml zdysocjowanej zawiesiny tkankowej na sitko komórkowe i dodać kolejne 4,5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+, aby przemyć komórki przez sitko komórkowe.
3. Komórki pasujące
- Dzień przed pasażowaniem pokryj płytki hodowli komórkowych 0,04% PEI.
- W dniu in vitro (DIV) 7 po rozbiorze umieścić 10-centymetrowe szalki z komórkami w DMEM+ na wytrząsarce laboratoryjnej w inkubatorze i wstrząsać szalkami z prędkością 110 obr./min przez 6 godzin.
- Zmyć PEI z powlekanych szkiełek nakrywkowych dwukrotnie dejonizowaną, destylowaną wodą. Dodać pożywkę NB+H do płytek (500 μl na dołek dla płytek 24-dołkowych i 2 ml na dołek dla płytek 6-dołkowych). Wstępnie wyrównać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 podczas wstrząsania 10-centymetrowych szalek lub przez co najmniej 30 minut.
- 20-30 minut przed końcem 6-godzinnego wstrząsania podgrzej 1x PBS, DMEM+, NB+H i 0,25% trypsyny-EDTA do 37 °C w łaźni wodnej.
- Po 6 godzinach wstrząsania zdejmij szalki hodowlane z wytrząsarki i natychmiast zastąp pożywkę (zawierającą strząśnięte neurony, oligodendrocyty i mikroglej) 10 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS na talerz.
nuta: Ważne jest, aby natychmiast zassać starą pożywkę zawierającą oderwane komórki, aby uniknąć ponownego przyłączenia się komórek nieastrocytowych.
- Usuń PBS i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA na danie. Inkubować każde naczynie przez 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2
- Dodaj 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM+ do 3 ml trypsyny-EDTA w każdym naczyniu, odpipetuj komórki z naczynia za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i zbierz zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Pipetę należy odpipetować bezpośrednio od spodu naczynia - podłoga naczynia powinna stać się bardziej przejrzysta w miarę odłączania się komórek. Używaj wyłącznie pożywki zawierającej surowicę (zamiast DMEM+), ponieważ surowica dezaktywuje trypsynę.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 3,220 x g w temperaturze 20 °C przez 4 minuty.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanego NB+H.
4. Posiewanie komórek do końcowych hodowli astrocytów
- Policz komórki.
- Płytka 20 000 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych (w 2 ml pożywki NB+H na studzienkę) lub 5 000 komórek na studzienkę w 24-dołkowej pożywce (w 500 μl pożywki NB+H na studzienkę).
- Hodowle komórkowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu dalszego traktowania lub analizy.
