$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Różnicowanie rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC do neuronów na 6-dołkowych MEA i szklanych szkiełkach nakrywkowych
UWAGA: W tym protokole podane są szczegóły dotyczące różnicowania rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC na dwóch różnych podłożach, tj. 6-dołkowych MEA (urządzenia składające się z 6 niezależnych dołków z 9 zapisami i 1 referencyjnym osadzonym mikroelektrodem na studzienkę) oraz szklanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki. Protokoły można jednak łatwo dostosować do większych podłoży (np. do studzienek z płytkami 12- lub 6-dołkowymi), skalując podane wartości w górę w zależności od powierzchni.
- Przygotuj MEA lub szklane szkiełka nakrywkowe (dzień 0 i dzień 1)
- Dzień przed rozpoczęciem różnicowania MEA należy wysterylizować zgodnie z zaleceniami producenta.
- Rozcieńczyć białko adhezyjne poli-L-ornitynę (PLO) w sterylnej ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 50 μg/ml. Pokryj obszar elektrody aktywnej 6-dołkowych MEA, umieszczając 100 μl kropli rozcieńczonego PLO w każdym dołku. Umieść szkiełka nakrywkowe w dołkach płytki 24-dołkowej za pomocą sterylnej pęsety. Dodać 800 μl rozcieńczonego PLO do każdej studzienki. Zapobiegaj unoszeniu się szkiełek nakrywkowych, dociskając je w dół za pomocą końcówki do pipet o pojemności 1000 μl.
- Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę O/N w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 . Następnego dnia odessać rozcieńczony PLO. Umyć szklane powierzchnie 6-dołkowych MEA i szkiełka nakrywkowe dwukrotnie sterylną ultraczystą wodą.
- Rozcieńczyć lamininę w zimnym DMEM/F12 do końcowego stężenia 20 μg/ml (dla 6-dołkowych MEA) i 10 μg/ml (dla szklanych szkiełek nakrywkowych). Natychmiast pokryj aktywny obszar elektrody 6-dołkowych MEA, umieszczając kroplę 100 μl w każdym dołku. Podobnie, dodać 400 μl rozcieńczonej lamininy do każdego dołka 24-dołkowej płytki, aby pokryć szkiełka nakrywkowe. Zapobiegaj unoszeniu się szkiełek nakrywkowych, dociskając je w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl.
- Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny.
- Umieść na talerzu hiPSC (dzień 1)
UWAGA: Objętości wymienione w krokach 3.2.1 - 3.2.4 zakładają, że rtTA/Ngn2-dodatnie hiPSC są hodowane na 6-dołkowej płytce i że komórki z jednego dołka są zbierane. Objętości wymagane do posiewu komórek na 6-dołkowych MEA i/lub szkiełkach nakrywkowych zależą od liczby 6-dołkowych MEA i/lub liczby szkiełek nakrywkowych, które są używane w doświadczeniu; Liczby określone w krokach 3.2.6 - 3.2.8 umożliwiają skalowanie do różnych rozmiarów eksperymentu.
- Ciepłe podłoże DMEM/F12, CDS i E8 z 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną do R/T. Dodać doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml i inhibitor ROCK do pożywki E8.
- Odessać zużytą pożywkę rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC i dodać 1 ml CDS do hiPSC. Inkubować 3 - 5 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki odłączają się od siebie.
- Dodać 2 ml DMEM/F12 do studzienki, delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 7 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
- Odessać supernatant i dodać 2 ml przygotowanej pożywki E8. Oddziel hiPSC, przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl do boku probówki o pojemności 15 ml i delikatnie zawieszając komórki. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są zdysocjowane.
- Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
nuta: Studzienka 6-dołkowa przy zbiegu 80 - 90% zwykle daje w sumie 3,0 - 4,0 x 106 komórek.
- Odessać rozcieńczoną lamininę. W przypadku 6-dołkowych MEA rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórkową 7,5 x 105 komórek/ml. Płytkie ogniwa należy dodać, dodając kroplę 100 μl zawiesiny ogniw na obszar elektrody aktywnej w każdym dołku z 6-dołkowych MEA. W przypadku szkiełek nakrywkowych rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek 4,0 x 104 komórki/ml. Płytkie komórki należy pokryć, dodając 500 μl zawiesiny komórek do dołków płytki 24-dołkowej.
nuta: Końcowa gęstość komórek na MEA jest wyższa niż na szkiełkach nakrywkowych (ryc. 1A i B). Odkryliśmy, że tak duża gęstość komórek była wymagana do prawidłowego rejestrowania aktywności sieciowej. W protokole podane są liczby, które były optymalne dla testów.
- Umieścić 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 przez 2 godziny (MEA) lub O/N (płytka 24-dołkowa).
- Po 2 godzinach ostrożnie dodać 500 μl przygotowanej pożywki E8 do każdego dołka z 6-dołkowych MEA. Umieścić 6-dołkowe MEA O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
- Zmień medium (dzień 2)
- Następnego dnia przygotuj DMEM/F12 z 1% (v/v) suplementem N-2, 1% (v/v) aminokwasami endogennymi i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać ludzką rekombinowaną neurotrofinę-3 (NT-3) do końcowego stężenia 10 ng/ml, ludzki rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
- Dodać lamininę do końcowego stężenia 0,2 μg/ml do pożywki. Przefiltruj powstałe medium. Odessać zużytą pożywkę z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę O/N w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
- Dodaj astrocyty szczura (dzień 3)
UWAGA: Objętości wymienione w tym protokole zakładają, że astrocyty szczurów są hodowane w kolbach hodowlanych T75. Bardzo ważne jest, aby astrocyty szczurów dodawane do kultur były dobrej jakości. Używamy dwóch kryteriów, aby sprawdzić, czy astrocyty szczurów są dobrej jakości. Po pierwsze, hodowla astrocytów szczurów powinna być w stanie zlać się w ciągu dziesięciu dni po izolacji od embrionalnych mózgów szczurów. Po drugie, po podzieleniu kultury astrocytów szczurów, astrocyty szczurów powinny być w stanie utworzyć zlewającą się, mozaikową monowarstwę (ryc. 1C). Jeśli hodowla astrocytów szczurów nie spełnia tych dwóch kryteriów, radzimy nie używać tej kultury do eksperymentów różnicujących.
- Podgrzej 0,05% trypsyny-EDTA do RT. Ogrzej DPBS i DMEM/F12 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do 37 °C.
- Odessać zużytą pożywkę z hodowli astrocytów szczura. Umyj kulturę, dodając 5 ml DPBS i delikatnie ją rozetrząśnij.
- Odessać DPBS i dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie przetrząśnij trypsyną-EDTA. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 - 10 minut.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Odłączyć ostatnie komórki, uderzając kilka razy w kolbę.
- Dodać 5 ml DMEM/F12 do kolby. Delikatnie roztrzeć komórki wewnątrz kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę o masie 200 x g przez 8 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM/F12. Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
- Dodaj 7,5 x 104 astrocyty na dołek 6-dołkowych MEA. Dodaj 2,0 x 104 astrocyty na dołek 24-dołkowej płytki. Inkubować MEA i 24-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Zmień podłoże (dzień 4)
- Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Ponadto dodać cytozynę β-D-arabinofuranozyd do stężenia 2 μM.
UWAGA: Cytozyna β-D-arabinofuranozyd jest dodawana do pożywki w celu zahamowania proliferacji astrocytów i zabicia pozostałych hiPSC, które nie różnicują się w neurony.
- Przefiltrować pożywkę i ogrzać ją do temperatury 37 °C. Odessać zużyte podłoże z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić je przygotowanym podłożem. Utrzymywać 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
- Odśwież podłoże (dzień 6 - 28)
UWAGA: Począwszy od 6 dnia, odświeżaj połowę podłoża co dwa dni. Od 10 dnia pożywka jest uzupełniana FBS, aby wspierać żywotność astrocytów.
- Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Począwszy od 10 dnia, należy również uzupełnić pożywkę o 2,5% (v/v) FBS. Przefiltrować powstałe podłoże i ogrzać je do temperatury 37 °C.
- Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl usunąć połowę zużytego podłoża z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Utrzymywać 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
