$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie kulek neuronalnych jako hodowli z wiszącej kropli (Dni in vitro (DIV) 0-3)
UWAGA: Opisane tutaj procedury przygotowania hodowli kulek neuronalnych są oparte na metodzie wcześniej opisanej przez grupę Sasaki z pewnymi modyfikacjami. Przyjęliśmy również kilka procedur z metody Bankera dla kultury dysocjowanej.
- Potwierdzenie następujących elementów przed rozpoczęciem sekcji
- Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i wcześniej wysterylizuj je w autoklawie/filtracji.
- Przygotuj wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie tej hodowli neuronów korowych.
- Spryskaj i wytrzyj komorę laminarnego przepływu powietrza, stół separacyjny, płytkę sceniczną mikroskopu stereoskopowego, nożyczki i kleszcze 70% etanolem.
- Poddaj mysz eutanazji po zastosowaniu CO2 i wypreparuj jamę brzuszną w celu uzyskania zarodków E16.
- Ostrożnie usunąć mózgi z zarodków za pomocą cienkich końcówek kleszczy i przenieść je do 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających 4 ml kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego, buforowanego roztworu soli HEPES (HBSS).
nuta: Pożywka preparcyjna HBSS zawiera 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM chlorku sodu (NaCl), 5,4 mM chlorku potasu (KCl), 1,09 mM wodorofosforanu disodu (Na2HPO4), 1,1 mM diwodorofosforanu potasu (KH2PO4), 5,6 mM D-glukozy i 5,64 μM czerwieni fenolowej.
- Usuń skórę głowy, odetnij opuszkę węchową, oddziel korę mózgową od każdej półkuli mózgowej za pomocą cienkich końcówek kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do kolejnych 60-milimetrowych szalek zawierających świeży HBSS. Użyj co najmniej 3-5 zarodków do każdej oddzielnej hodowli kulki neuronalnej.
- Pokrój korę na małe kawałki za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym.
- Przenieś zmieloną korę mózgową do probówki o pojemności 15 ml i trypsynizuj zmieloną korę w 4 ml 0,125% trypsyny w HBSS przez 4,5 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
nuta: Ten czas trypsynizacji ma kluczowe znaczenie dla wydajnej hodowli neuronów, ponieważ wydłużający się czas (> 4,5 minuty) prowadzi do znacznie większej liczby martwych neuronów.
- Przenieść agregaty komórek do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml HBSS za pomocą sterylnej pipety transferowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
- Przenieś agregaty komórkowe do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki neuropodstawowej zawierającej GlutaMax, suplement B27 (pożywka NGB), 0,01% DNazy I i 10% surowicy końskiej.
- Trypsynizowane korki należy rozcierać, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół (3-5 razy) za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z drobnego szkła.
nuta: Średnica pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła drobnego jest bardzo ważna, jak opisano w artykule dotyczącym metody Bankera. Jeśli pipeta jest zbyt wąska, aby przejść przez korę mózgową, przygotuj pipety o 2-3 różnych rozmiarach i spróbuj użyć większej pipety.
- Aby przygotować kulki neuronowe, weź powyższą zawiesinę komórkową i dostosuj gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki NGB.
- Hoduj neurony korowe w postaci wiszących kropli zawierających 10 000 komórek / kroplę (1 kropla to 10 μl) wewnątrz górnych powiek 10 cm naczyń hodowlanych.
- Dodać 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do dolnej części szalek hodowlanych, a następnie przechowywać w inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnych warunkach, aby umożliwić tworzenie się kuli neuronalnej.