$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie kultury zdysocjowanego dorosłego zwoju korzenia grzbietowego Neuron lub neuronu DRG
- Przed założeniem kultury należy wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę poli-D-lizyną i lamininą. Inkubować 6-dołkową płytkę z 0,01% poli-D-lizyną w temperaturze 37°C przez 2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną.
- Inkubować płytkę z roztworem lamininy o stężeniu 3 μg/ml przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą destylowaną. Suszyć płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
- Poddaj eutanazji mysz w przezroczystej komorze CO2 podłączonej do butli ze sprężonym gazem CO2. Naciąć skórę przylegającą do kręgosłupa za pomocą ostrza chirurgicznego i wypreparować mięśnie przykręgosłupowe obustronnie, aby odsłonić kości kręgowe. Usuń kości kręgowe skrupulatnie za pomocą wąskiego rongeura chirurgicznego, aż DRG zostaną całkowicie odsłonięte.
nuta: Dorosłe neurony DRG pozyskiwane są od dorosłych samców myszy C57BL6 w wieku od 8 tygodni do 12 tygodni.
- Usuń DRG obustronnie od S1 aż do poziomu C1 za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczyków z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym. Staraj się całkowicie wyciąć korzenie z DRG, aby zminimalizować zanieczyszczenie komórek Schwanna lub fibroblastów.
- Przechowuj rozcięte DRG na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) na lodzie, aż wszystkie DRG będą następnym krokiem, nawet jeśli nadal pozostaną DRG.
nuta: Bardzo ważne jest, aby jak najszybciej przeanalizować DRG. Pobranie wszystkich DRG od jednej myszy nie powinno trwać dłużej niż 30 minut. 30 minut po eutanazji należy przerwać pobieranie DRG i przejść do przeniesienia DRG do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml za pomocą niebieskiej końcówki pipety (1000 μL) z odciętym końcem. Usuń DMEM po szybkim wirowaniu przez kilka sekund za pomocą mini wirówki. Dodać 1 ml DMEM zawierającego 125 U/ml kolagenazy typu XI i inkubować probówkę przez 90 minut z delikatnym obrotem (35-40 obr./min) za pomocą wytrząsarki typu twister w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Unieruchom rurkę na podłodze wytrząsarki za pomocą taśmy.
- Wyrzuć DMEM zawierający kolagenazę i dodaj 1 ml świeżego DMEM. Poczekaj, aż pływające DRG całkowicie opadną na dno, a następnie usuń DMEM wraz z resztkami tkanki. Powtórz ten etap prania co najmniej sześć razy.
nuta: Nie należy próbować całkowicie wyrzucić supernatantu. Należy uważać, aby nie usunąć żadnych DRG za pomocą supernatantu DMEM.
- Przenieś DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą niebieskiej końcówki pipety (1000 μl) z odciętym końcem. Następnie delikatnie pipetować w górę i w dół co najmniej 15 razy za pomocą niebieskiej końcówki (1000 μl), aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Unikaj robienia bąbelków i staraj się nie dotykać dna stożkowej rurki końcówką pipety.
- Odwirować probówkę o sile 239 x g przez 3 minuty i ostrożnie wyrzucić supernatant wraz z pływającymi zanieczyszczeniami. Dodać 1 ml pożywki Neurobaseal z dodatkiem witaminy B27 (2,0% v/v) i ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół od 5 do 10 razy.
- Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm nałożone na stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Odczekaj 2 minuty, a następnie wylej pożywkę Neurobasal/B-27 na sitko za pomocą kontrolera pipet.
- Umieść wszystkie zebrane neurony DRG (około 2 x 106 neuronów DRG z jednej myszy) na dwóch dołkach 6-dołkowej płytki. Neurony DRG od jednej dorosłej myszy pokrywają dwie studzienki w 6-dołkowej płytce. Następnie umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C, aż makrofagi ulegną kokulturom.
2. Współhodowla pierwotnych makrofagów otrzewnowych na wkładce do hodowli komórkowej
UWAGA: Ustal kokultury 4 godziny po początkowym posiewie zdysocjowanych neuronów DRG
- Pierwotne makrofagi otrzewnowe przygotowuje się z dorosłych samców myszy C57BL6 w wieku od 8 tygodni do 12 tygodni. Poddaj zwierzę eutanazji w komorze CO2. Delikatnie naciąć skórę brzucha, odsłonić otrzewną i unikać przecinania otrzewnej, aby zapobiec wyciekowi płynu z płukania.
- Nakłuć otrzewną za pomocą strzykawki z igłą 22G i wstrzyknąć 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do jamy otrzewnej. Delikatnie masuj otrzewną przez 1-2 min. Następnie wyciągnij igłę i wyciśnij PBS przez miejsce wkłucia igły i zbierz płyn z płukania do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Przed użyciem należy umieścić strzykawkę na lodzie, aby utrzymać chłód PBS.
- Odwirować płyn popłuczynowy o stężeniu 239 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia składników komórkowych. Zawiesić osad z 3 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować zawiesinę komórek przy 239 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad w 3 ml PBS i ponownie odwirować zawiesinę komórkową w celu usunięcia pozostałego buforu do lizy RBC.
nuta: Upewnij się, że bufor do lizy RBC został całkowicie usunięty. W przeciwnym razie pozostały bufor do lizy RBC może być toksyczny dla hodowanych makrofagów.
- Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki Neurobaseal/B-27. Połowę wszystkich zebranych makrofagów (w sumie 3 × 106 do 6 x 106 komórek) umieścić na płytce do hodowli komórkowej o efektywnej powierzchni 4,2cm2, którą umieszcza się na wierzchu studzienki zdysocjowanego DRG.
nuta: W okresie kohodowli makrofagi są hodowane w pożywce do hodowli neuronów Neurobasel/B-27. Potwierdzono odpowiednią przeżywalność makrofagów w tym stanie.
3. Leczenie db-cAMP (dibutyrylowo-cykliczne AMP) i pobieranie makrofagów CM
UWAGA: Rozpocznij leczenie db-cAMP 4 godziny po kokulturach neuronów i makrofagów.
- Dodaj 2 μl 100 μM roztworu db-cAMP do kokultur neuronów i makrofagów. Dodaj tę samą objętość PBS dla eksperymentu kontrolnego.
- Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę 1 ml pożywki do hodowli makrofagów na tej samej 6-dołkowej płytce. Przenieść wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturach neuronów i makrofagów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów. Utrzymuj komórki w tym samym stanie przez 72 godziny bez zmiany podłoża.
nuta: Podczas pobierania CM dodajemy tylko 1 ml pożywki do hodowli makrofagów, aby uzyskać skoncentrowany CM. Podczas zbierania CM, jeśli zaszła taka potrzeba, dodaliśmy więcej, aby całkowicie pokryć makrofagi we wkładce.
- Po 72 godzinach odwirować makrofag CM przy 239 x g przez 5 minut w celu usunięcia składników komórkowych. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe. Zebrany CM należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.