1. Leczenie obozu Db i zbieranie pożywki kondycjonowanej makrofagami
UWAGA: Rozpocznij leczenie db-cAMP 4 godziny po kokulturach neuronów i makrofagów.
- Dodać 2 μl 100 μM roztworu cyklicznego AMP dibutyrylu (db-cAMP) do kokultur neuronów i makrofagów. Dodać taką samą objętość soliny buforowanej fosforanami (PBS) do eksperymentu kontrolnego.
- Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę 1 ml pożywki do hodowli makrofagów na tej samej 6-dołkowej płytce. Przenieść wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturach neuronów i makrofagów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów. Utrzymuj komórki w tym samym stanie przez 72 godziny bez zmiany podłoża.
nuta: Dodajemy tylko 1 ml pożywki do hodowli makrofagów podczas pobierania kondycjonowanej pożywki (CM), aby uzyskać skoncentrowany CM. Podczas zbierania CM, jeśli zaszła taka potrzeba, dodaliśmy więcej, aby całkowicie pokryć makrofagi we wkładce.
- Po 72 godzinach odwirować makrofag CM przy 239 x g przez 5 minut w celu usunięcia składników komórkowych. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe. Zebrany CM należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.
2. Test wzrostu neurytu z pobranym CM
- Przed założeniem oddzielnej hodowli neuronów dorosłego DRG należy wstępnie pokryć 8-dołkowe szkiełko komorowe poli-D-lizyną i lamininą. Inkubować 6-dołkową płytkę z 0,01% poli-D-lizyną w temperaturze 37°C przez 2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną.
- Inkubować płytkę z roztworem lamininy o stężeniu 3 μg/ml przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą destylowaną. Suszyć płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
- Uzyskaj zdysocjowane dorosłe neurony DRG w podłożu neurobazalnym uzupełnionym witaminą B27. Płytka 5 x 104 komórki na studzienkę na wstępnie powlekanym szkiełku 8-dołkowym.
- Umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny, pozwalając komórkom przymocować się do dna. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną rozmrożonym CM, który jest wstępnie podgrzany do 37 °C.
nuta: Należy uważać, aby nie dotknąć dna szkiełka 8-dołkowego podczas wyjmowania pożywki hodowlanej i dodawania zebranego CM.
- 15 godzin po wstępnym posiewie usunąć pożywkę i raz przemyć komórki PBS. Następnie dodać 200 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu do studzienek i inkubować komórki z roztworem paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze 4 °C
nuta: Posiew neuronów DRG do oznaczania wzrostu neurytów powinien być precyzyjnie ograniczony do 15 godzin. W tym stanie nie ma znaczącego wyrostu neurytów.
- Przemyć trzykrotnie lodowatym PBS, a następnie wykonać blokowanie 10% normalną surowicą kozią (NGS) z 0,1% Triton-X przez 30 minut. Inkubować utrwalone komórki roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (anty-Tuj-1) rozcieńczonym 10% NGS (w stężeniu 1 μg/ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przemyć trzykrotnie PBS, a następnie inkubować komórki z roztworem przeciwciał drugorzędowych (koza-anty mysz) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć dwukrotnie PBS i zamontować szkiełko hodowlane za pomocą szkiełka nakrywkowego (24 × 50 mm) za pomocą roztworu montażowego.
- Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić przerost neurytów (ryc. 1).
