Artykuł metodologiczny

Używanie pożywki kondycjonowanej makrofagami w celu promowania rozszerzeń neuronów

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Yun, H. J., et al. Neuro-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test wspomagający wzrost projekcji neuronów, znany jako wzrost neurytów przy użyciu pożywki kondycjonowanej makrofagami. Współhoduj neurony i makrofagi za pomocą cAMP i zbieraj kondycjonowaną pożywkę pochodzącą z makrofagów. Hodowla neuronów za pomocą kondycjonowanej pożywki sprzyja wyrostkom neurytów. Te wyrostki są znakowane fluorescencyjnie i wizualizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Leczenie obozu Db i zbieranie pożywki kondycjonowanej makrofagami

UWAGA: Rozpocznij leczenie db-cAMP 4 godziny po kokulturach neuronów i makrofagów.

  1. Dodać 2 μl 100 μM roztworu cyklicznego AMP dibutyrylu (db-cAMP) do kokultur neuronów i makrofagów. Dodać taką samą objętość soliny buforowanej fosforanami (PBS) do eksperymentu kontrolnego.
  2. Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę 1 ml pożywki do hodowli makrofagów na tej samej 6-dołkowej płytce. Przenieść wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturach neuronów i makrofagów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów. Utrzymuj komórki w tym samym stanie przez 72 godziny bez zmiany podłoża.
    nuta: Dodajemy tylko 1 ml pożywki do hodowli makrofagów podczas pobierania kondycjonowanej pożywki (CM), aby uzyskać skoncentrowany CM. Podczas zbierania CM, jeśli zaszła taka potrzeba, dodaliśmy więcej, aby całkowicie pokryć makrofagi we wkładce.
  3. Po 72 godzinach odwirować makrofag CM przy 239 x g przez 5 minut w celu usunięcia składników komórkowych. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe. Zebrany CM należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.

2. Test wzrostu neurytu z pobranym CM

  1. Przed założeniem oddzielnej hodowli neuronów dorosłego DRG należy wstępnie pokryć 8-dołkowe szkiełko komorowe poli-D-lizyną i lamininą. Inkubować 6-dołkową płytkę z 0,01% poli-D-lizyną w temperaturze 37°C przez 2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną.
  2. Inkubować płytkę z roztworem lamininy o stężeniu 3 μg/ml przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą destylowaną. Suszyć płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Uzyskaj zdysocjowane dorosłe neurony DRG w podłożu neurobazalnym uzupełnionym witaminą B27. Płytka 5 x 104 komórki na studzienkę na wstępnie powlekanym szkiełku 8-dołkowym.
  4. Umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny, pozwalając komórkom przymocować się do dna. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną rozmrożonym CM, który jest wstępnie podgrzany do 37 °C.
    nuta: Należy uważać, aby nie dotknąć dna szkiełka 8-dołkowego podczas wyjmowania pożywki hodowlanej i dodawania zebranego CM.
  5. 15 godzin po wstępnym posiewie usunąć pożywkę i raz przemyć komórki PBS. Następnie dodać 200 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu do studzienek i inkubować komórki z roztworem paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze 4 °C
    nuta: Posiew neuronów DRG do oznaczania wzrostu neurytów powinien być precyzyjnie ograniczony do 15 godzin. W tym stanie nie ma znaczącego wyrostu neurytów.
  6. Przemyć trzykrotnie lodowatym PBS, a następnie wykonać blokowanie 10% normalną surowicą kozią (NGS) z 0,1% Triton-X przez 30 minut. Inkubować utrwalone komórki roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (anty-Tuj-1) rozcieńczonym 10% NGS (w stężeniu 1 μg/ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyć trzykrotnie PBS, a następnie inkubować komórki z roztworem przeciwciał drugorzędowych (koza-anty mysz) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć dwukrotnie PBS i zamontować szkiełko hodowlane za pomocą szkiełka nakrywkowego (24 × 50 mm) za pomocą roztworu montażowego.
  8. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić przerost neurytów (ryc. 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki testu przerostu neurytów przy użyciu kondycjonowanej pożywki uzyskanej w różnych warunkach. (A, B) Dorosłe neurony DRG zostały ostro zdysocjowane i hodowane dokładnie przez 15 godzin. 2 godziny po posianiu pożywkę hodowlaną zastąpiono kondycjonowaną pożywką (CM) uzyskaną z kokultur neuronów i makrofagów traktowanych PBS (A) lub dibutyrylem cAMP (db-cAMP) (B). Tylko ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wkładka do hodowli komórkowej przezroczysta membrana PET o wielkości porów 0,4 μmCorning, SokółNumer katalogowy: 353090Przezroczysta membrana PET o wielkości porów 0,4 μm, do płytki 6-dołkowej
Sitko do komórek nylonowych 70 μmCorning, SokółNumer katalogowy: 352350
8-dołkowa szkiełko hodowlanePowłoka biologiczna354632z równomiernym zastosowaniem poli-D-lizyny
Podłoże nerwowo-podstawoweThermo Fisher Scientific, Gibco21103-049Zawiera 1% glutamax i 1% penicyliny-streptomycyny
Suplement B-27, bez surowicyThermo Fisher Scientific, GibcoNumer katalogowy: 17504-044Roztwór zewnątrzkomórkowy
Glutamax (Glutamax)Thermo Fisher Scientific, GibcoNumer telefonu 35050-061
Penicylina-streptomycynaThermo Fisher Scientific, GibcoRozdział 15140-122
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichZobacz materiał P6407-5MG
LamininaThermo Fisher Scientific, Invitrogen23017-015
Adenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan, N6,O2'-dibutyryl-, sól sodowaMerck Millipore Corporation, CalbiochemNumer katalogowy: 28745
10% normalna surowica koziaThermo Fisher Naukowy16210072
Tryton-X-100Daejung Chemical and Metal Co8566-4405
Tubulina anty β III (Tuj-1)Korporacja PromegaZobacz materiał G7121Mysie przeciwciało monoklonalne
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA11005
HemacytometrMarienfeld-SuperiorN/a
Inkubator CO2 do hodowli komórkowychPanasonicN/a
Wirówka stołowaSorvall (Sorvall)N/a
Mikroskop konfokalnyOlympus Ameryka IncZobacz materiał IX71
FBS (płodowa surowica bydlęca)VWR International, HydroklonSH30919.03

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurite OutgrowthNeuron Macrophage Co culturecAMP TreatmentFluorescence MicroscopyCentrifugation ProtocolParaformaldehyde FixationPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesPoly D lysine Coating

Powiązane artykuły