Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie komory mikroprzepływowej lub MFC
- Odlewanie PDMS w formach pierwotnych (rysunek 1)
- Kup lub stwórz podstawowe formy (wafle) zgodnie ze szczegółowym protokołem.
- Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkiego rodzaju zabrudzenia z platformy wafla przed przejściem do etapu powlekania. Powierzchnia wafli powinna wyglądać na gładką i wyraźną.
- Napełnij pojemnik 50 ml ciekłego azotu. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml i igłę 23 g.
nuta: Wszystkie zabiegi od tego kroku naprzód muszą być wykonywane w kapturze chemicznym.
- W kapturze chemicznym za pomocą strzykawki i igły zebrać 2 ml ciekłego azotu. Chociaż może się wydawać, że powietrze zostało zassane, strzykawka jest wypełniona azotem (ryc. 1A). Umieść płytkę zawierającą wafel w zamykanym pojemniku.
- Zakręcić butelkę z chlorotrimetylosilanem, przekłuć gumową nakrętkę za pomocą strzykawki wypełnionej azotem i wstrzyknąć całą zawartość strzykawki do butelki. Nie wyciągając igły, odwróć butelkę do góry dnem i odciągnij 2 ml chlorotrimetylosilianu.
nuta: Ze względu na ciśnienie w strzykawce, niewielka ilość chlorotrimetylosililanu jest rozpylana z igły. Aby uniknąć zagrożenia, skieruj igłę w stronę wewnętrznej ścianki okapu (Rysunek 1B).
- Chlorotrimetylosilan rozprowadzić równomiernie w pojemniku (od kroku 1.1.4), ale nie bezpośrednio na płytce lub płytce zawierającej płytkę. Zamknąć pojemnik i inkubować przez 5 minut na płytkę.
nuta: Jeżeli płytka jest powlekana chlorotrimetylosilanem po raz pierwszy, należy pozostawić 1 godzinę inkubacji dla każdej płytki.
- Nie wyjmuj wafli i pojemnika z okapu chemicznego przez 30 min.
ostrożność: Chlorotrimetylosilan jest bardzo lotny.
- Zważyć bazę PDMS (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml i dodać utwardzacz PDMS w stosunku 16:1 odpowiednio (np. 47,05 g bazy i 2,95 g utwardzacza). Mieszać przez 10 minut za pomocą rotatora wolnoobrotowego.
- Wlej PDMS do każdej płytki zawierającej wafel na żądaną wysokość (Rysunek 1C).
nuta: Stosowanie cienkich komór mikroprzepływowych (do 3-4 mm) poprawia przyleganie do naczynia hodowlanego i zapobiega wyciekom.
- Umieść wszystkie płytki razem w eksykatorze próżniowym na 2 godziny (Rysunek 1E). Proces ten usuwa powietrze uwięzione w PDMS, eliminując w ten sposób pęcherzyki powietrza i tworząc przezroczystą, jednolitą pleśń.
- Umieść talerze w piekarniku na 3 godziny (lub przez noc) w temperaturze 70 °C (Rysunek 1E).
nuta: Po włożeniu do piekarnika talerze powinny być wypoziomowane.
- Odlewanie PDMS w formach epoksydowych
nuta: Ponieważ przygotowanie wafli jest drogie, wymaga specjalnego sprzętu i może uszkodzić kruche płytki, możliwe jest wygenerowanie epoksydowych replik wafli. Repliki są tańsze, trwalsze i mogą być wykorzystywane do masowej produkcji komór mikroprzepływowych.
- Odlewać i utwardzać PDMS (zgodnie z opisem w 1.1.8-1.1.11) do oryginalnej płytki.
- Usuń i odetnij nadmiar części PDMS, pozostawiając tylko elementy mikroprzepływowe i obszar funkcjonalny wymagany do przetworzenia ich na komory mikroprzepływowe.
- Natychmiast owiń PDMS grubą, lepką taśmą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
- Wybierz plastikowe naczynie do hodowli tkankowych, które mieści się w całym PDMS w środku i pozostaw wokół niego miejsce na żywicę epoksydową. Odległość od PDMS do plastikowego naczynia powinna być mniejsza niż 5 mm.
- Przygotować niewielką ilość PDMS wymieszaną w proporcji 10:1 (baza: utwardzacz). Świeży płynny PDMS zostanie użyty do przyklejenia stałego PDMS do dolnej części plastikowej płytki.
- Nałóż minimalną ilość płynnego PDMS na środkowe dno plastikowej płytki, a następnie usuń taśmę klejącą z PDMS i przyklej ją do plastikowego dna naczynia. Upewnij się, że elementy mikroprzepływowe są skierowane do góry.
- Pozostaw PDMS na utwardzenie przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 70 °C.
- Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając bazę i utwardzacz w proporcji 100:45 odpowiednio w probówce. Różne żywice epoksydowe mogą mieć różne proporcje mieszania. Wymagana objętość dla zwykłej płytki o średnicy 100 mm wynosi około 40 ml.
- Pozwól żywicy epoksydowej dobrze wymieszać przez 10 minut w rotatorze, aż mieszanina stanie się widocznie jednorodna (tj. w cieczy nie ma widocznych artefaktów przypominających włókna).
- Odwirować mieszaninę epoksydową o sile 400 x g przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w środku.
- Podczas wirowania rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego wokół ścianek i wszystkich innych odsłoniętych plastikowych części naczynia hodowlanego. Zapobiegnie to polimeryzacji żywicy epoksydowej z tworzywem sztucznym naczynia i umożliwi łatwe usunięcie utwardzonej żywicy epoksydowej po zakończeniu protokołu.
- Powoli wlewaj żywicę epoksydową do naczynia, aż całkowicie zakryje PDMS i wyjdzie poza niego na co najmniej 5 mm. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków w żywicy epoksydowej, zachowując zerową odległość między rurką a płytą. Umieść płytkę w bezpiecznym miejscu, aby nie była przesuwana przez następne 48 godzin.
- Po 48 h żywica epoksydowa powinna być całkowicie utwardzona. Włóż płytkę do piekarnika nagrzanego do 80 °C na 3 godziny w celu ostatecznego utwardzenia.
- Usuń utwardzoną żywicę epoksydową z płyty i oryginalnej formy PDMS, delikatnie szarpiąc plastikową ściankę płytki, aż pęknie. Następnie powinien łatwo oddzielić się od żywicy epoksydowej i odkleić się.
- Po wyjęciu zetrzyj pozostały tłuszcz z nowej repliki epoksydowej i włóż ją do góry nogami (tj. z replikowanymi elementami mikroprzepływowymi skierowanymi do góry) do nowego naczynia hodowlanego. Replika epoksydowa jest teraz gotowa do odlewania PDMS.
- Użyj sprężonego powietrza lub N2, aby zdmuchnąć wszelkie pozostałości PDMS lub brud z formy epoksydowej i spłucz ją 2x izopropanolem. Napełnij go po raz trzeci i inkubuj przez 10 minut na orbitalnej płytce wytrząsarki. Ponownie opłucz formę 3x izopropanolem i wylej pozostały płyn. Wysuszyć suszarką z użyciem powietrza lub N2 lub wstawić do piekarnika o temperaturze 70 °C do wyschnięcia.
nuta: Postępuj zgodnie z procedurami bezpieczeństwa podczas pracy z izopropanolem i jego wyrzucania.
- Utrzymuj płyty formy zamknięte do momentu odlewania. Wykonaj kroki 1.1.8.-1.1.11.
- Wykrawanie i rzeźbienie PDMS w MFC (rysunek 2)
- Wytnij i usuń formę PDMS z płytki, postępując zgodnie ze znakami (+) na waflach za pomocą skalpela. Nie używaj siły, ponieważ formy są delikatne (Rysunek 2A).
- Postępuj zgodnie z instrukcjami narysowanymi na szkicu, aby przebić i przeciąć komory w zależności od konfiguracji eksperymentalnej (Rysunek 2B-F).
- W przypadku hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego (ryc. 2C, E) przebij dwie 7-milimetrowe studzienki w dystalnej stronie dużego MFC. Zlokalizuj studnie w taki sposób, aby zachodziły na krawędzie kanału. Po stronie proksymalnej przebij jedną studzienkę o średnicy 7 mm w środku kanału, przy minimalnym zachodzeniu na siebie, tak aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na eksplantaty. Przebij dwa dodatkowe otwory o średnicy 1 mm w dwóch krawędziach kanału proksymalnego. Obróć płytę melaminowaną z elementami mikroprzepływowymi skierowanymi do góry i za pomocą igły 20 G wytnij trzy małe jaskinie eksplantacji na wybitej studni o średnicy 7 mm.
- W przypadku zdysocjowanej hodowli MN (rysunek 2D, F) należy przebić cztery dołki o średnicy 6 mm w krawędziach dwóch kanałów małego MFC.
- Sterylizacja MFC do użytku w kulturach tkankowych
- Rozłóż na ławce taśmy klejące o długości 50 cm. Naciśnij i odciągnij komorę tak, aby była skierowana w stronę taśmy klejącej (zarówno górna, jak i dolna powierzchnia) i usuń surowy brud. Umieść czyste komory w nowym talerzu o średnicy 15 cm.
nuta: Nie naciskaj bezpośrednio na elementy mikroprzepływowe, gdy są one skierowane do góry.
- Inkubować komory w 70% etanolu klasy analitycznej przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.
- Wyrzucić etanol i wysuszyć komory w okapie do hodowli tkankowych lub w piecu w temperaturze 70 °C.
- Umieszczanie płyty melaminowanej na naczyniu ze szklanym dnem
- Umieść komorę w środku szklanego naczynia z dnem klasy hodowli tkankowej 35 mm/50 mm i przyłóż niewielką siłę do krawędzi, aby PDMS i dno naczynia się związały. Aby uniknąć stłuczenia szklanego dna, zawsze przykładaj siłę do twardej powierzchni.
- Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Ścisnąć komory, aby wzmocnić przyleganie do płytki.
- Inkubować w świetle UV przez 10 minut.
- Powlekanie i hodowla
- Dodaj 1,5 ng/ml poli-L-ornityny (PLO) do obu komór. Upewnij się, że PLO przepływa przez kanały, pipetując medium powlekające kilka razy bezpośrednio w wejściu do kanału.
- Zbadaj komorę mikroprzepływową pod mikroskopem świetlnym o 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli pęcherzyki powietrza blokują mikrorowki, umieść MFC w eksykatorze próżniowym na 2 minuty. Później usuń nadmiar powietrza, które dostało się do kanałów, pipetując przez nie media powlekające. Inkubować przez noc.
- Zastąp PLO lamininą (3 μg/ml w DDW) do inkubacji przez noc w ten sam sposób.
- Przed posiewem przemyj lamininę pożywką do hodowli neuronów.
2. Posiewanie kultur neuronalnych
- Posiew eksplantatów rdzenia kręgowego
- Za pomocą prostych nożyczek i cienkich kleszczy wypreparuj rdzeń kręgowy z zarodka myszy E12.5 ICR-HB9:GFP. Pracuj w roztworze 1X HBSS z 1% penicyliną-streptomycyną (P / S) (Rysunek 3A-C).
- Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń opony mózgowe i rogi grzbietowe (ryc. 3D).
- Przeciąć rdzeń kręgowy na odcinki poprzeczne o grubości 1 mm (ryc. 3E). Usunąć całe podłoże z proksymalnej komory MFC.
- Pobrać pipetą pojedynczy eksplant rdzenia kręgowego o łącznej objętości 4 μl. Wstrzyknąć eksplant jak najbliżej jaskini i wyciągnąć nadmiar płynu z dołu proksymalnego przez boczne ujścia (stemple 1 mm). Eksplantaty należy zassać do kanału proksymalnego.
- Powoli dodawać 150 μl pożywki eksplantacyjnej do rdzenia kręgowego (SCEX, patrz tabela materiałów i tabela 3) do studzienki proksymalnej.
- Utrzymanie hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego
- Dodać pożywkę SCEX do przedziału proksymalnego i bogatą pożywkę SCEX (SCEX z 50 ng/ml BDNF i GDNF) do przedziału dystalnego. Utrzymać gradient objętości wynoszący co najmniej 15 μl na studzienkę między studzienkami dystalnymi (większa objętość) a studzienką proksymalną.
- Odświeżaj podłoże co 2 dni. Dystalne skrzyżowanie aksonów może zająć do 3-5 dni.
3. Transport aksonalny (Rysunek 4A)
- Znakowanie mitochondriów i kompartmentów kwasowych
- Przygotuj świeżą pożywkę SCEX (lub CNB dla zdysocjowanego MN) zawierającą 100 nM Mitotracker Deep Red FM i 100 nM LysoTracker Red. Inkubować przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C. Inne kolory mogą być używane, o ile ich fluorofory nie zachodzą na siebie.
- Umyć 3x ciepłym medium CNB/SCEX. Płytki są gotowe do obrazowania.
- Obrazowanie na żywo
- Wykonaj 100 serii zdjęć poklatkowych z transportem aksonalnym w odstępach 3 s, łącznie 5 minut na film.
nuta: System obrazowania wykorzystany w tym badaniu obejmował odwrócony mikroskop wyposażony w konfokal z wirującym dyskiem, sterowany za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania komórek, 60-krotną soczewkę olejową, NA = 1,4 oraz kamerę EMCCD. Filmy zostały zarejestrowane w kontrolowanym środowisku w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: W zależności od eksperymentu można tworzyć dłuższe lub krótsze filmy poklatkowe. W razie potrzeby można nagrywać nawet filmy z nocy. Jednak bardzo ważne jest, aby spróbować skrócić czas naświetlania i moc lasera, a także liczbę całkowitych obrazów, aby zmniejszyć fototoksyczność i wybielanie podczas pozyskiwania filmów.
