Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie materiałów
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia i ddH2O za pomocą autoklawu przed wykonaniem eksperymentu. Instrumenty obejmują między innymi nożyczki chirurgiczne, nożyczki okulistyczne, kleszcze, łyżki, rozdzielacze jądra, szklane naczynia (o średnicy 60–100 mm) i szklane zlewki.
- Przygotować roztwór Krebsa (Tabela 1): Przed użyciem rozpuścić wszystkie chemikalia za pomocą ddH2O. Rozpuścić CaCI2 oddzielnie i powoli dodawać do wymieszanego roztworu, mieszając, aby uniknąć osadu.
- Przygotuj pożywkę do płukania, która składa się z pożywki F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem/antybiotykiem przeciwgrzybiczym (100x). Dodaj 5 ml FBS i 0,5 ml antybiotyku/antybiotyku do 44,5 ml pożywki F12.
- Przygotuj pożywkę neuronalną A, która składa się z pożywki neuropodstawowej A z 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutaminy, 1% antybiotyku/antybiotyku (100x) i 0,1% neurotroficznego czynnika glejowego (GDNF). Dodaj 200 μl witaminy B-27, 100 μl FBS, 100 μl L-glutaminy, 100 μl antybiotyku/antybiotyku (100x) i 10 μl GDNF (10 μg/ml) do 9,5 ml pożywki neurobazalnej A.
nuta: Przygotuj pożywkę neuronową A w ciągu tygodnia od użycia, aby zapewnić świeżość witaminy B-27, L-glutaminy i GDNF.
- Przygotuj pożywkę neuronową B, stosując tę samą procedurę, co przygotowanie pożywki neuronalnej A, ale bez dodawania FBS.
- Przygotuj roztwór wytrawiający 1, rozpuszczając 20 mg kolagenazy typu II, 6 mg albuminy surowicy bydlęcej i 200 μl antybiotyku/antybiotyku (100x) w 10 ml stabilnego tlenowo roztworu Krebsa.
- Przygotuj roztwór trawiący 2, rozcieńczając 1 ml 0,25% trypsyny z 4 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka.
- Przygotuj talerz z powlekanymi szkiełkami nakrywkowymi.
- Używaj kleszczy w ławce z przepływem laminarnym podczas umieszczania szklanych szkiełek nakrywkowych na 48-dołkowej płytce hodowlanej.
- Rozcieńczyć poli-D-lizynę ddH2O do stężenia 0,1 mg/ml w postaci poli-D-lizyny. Przechowywać wywar w temperaturze –20 °C i rozmrozić przed
- Dodać 40 μl bulionu poli-D-lizyny na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min.
nuta: Dostosuj stężenie do 4 μg/cm2 dla różnych płytek o różnych powierzchniach podstawowych. Na przykład, jeśli powierzchnia podstawowa jednej studzienki z płytki 24-dołkowej wynosi 2cm2, powinniśmy przenieść 80 μl osadu z poli-D-lizyny do studzienki. Każdycm2 zawierałby 4 μg poli-D-lizyny.
- Usunąć poli-D-lizynę z płytki 48-dołkowej i trzykrotnie spłukać szkiełka nakrywkowe ddH2O.
- Suszyć płytkę w okapie z przepływem laminarnym przez co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że płytka jest bezwodna.
- Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przed pokryciem lamininą najwyżej przez 1 dzień. W przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie płytki w temperaturze -20 °C.
- Rozmrozić lamininę w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć lamininę z ddH2O do stężenia 50 μg/ml w postaci lakininy. Przechowywać wywar w temperaturze –20 °C i rozmrozić w temperaturze 4 °C przed użyciem.
- Za pomocą pipety przenieś 100 μl rozcieńczonej lamininy na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj lamininę w temperaturze 4 °C przez 1 h.
nuta: Dostosuj stężenie do 5 μg/cm2 dla różnych płytek o różnych powierzchniach podstawowych. Na przykład, jeśli powierzchnia podstawowa jednej studzienki z płytki 24-dołkowej wynosi 2cm2, przenieś 200 μl rozcieńczonej lamininy do studzienki. Każdycm2 zawierałby 5 μg lamininy.
- Usunąć roztwór lamininy i raz spłukać szkiełka nakrywkowe ddH2O. Wykonaj tę operację na krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć skrobania.
nuta: Powlekane szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 tygodnie.
2. Zbiór pęcherza
- Zdobądź pięciotygodniowe szczury Sprague-Dawley.
- Wlej karbogen (95% tlenu, 5% CO2) do roztworu Krebsa przez co najmniej 30 minut w łaźni lodowej, aby osiągnąć stabilny stan tlenu i poziom pH.
- Po eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy szczury należy namoczyć w 75% etanolu przez 30 sekund w celu sterylizacji.
- Umieść szczury na wysterylizowanym ręczniku chirurgicznym i odsłoń ich brzuch. Otwórz jamę brzuszną i odsłoń pęcherz za pomocą zestawu nożyczek i kleszczy.
- Delikatnie podnieś pęcherz i odetnij pęcherz od szyi pęcherza innym zestawem nożyczek i kleszczy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Szybko umieść pęcherz w zimnym, stabilnym tlenie roztworze Krebsa, aby poprawić przeżywalność komórek.
nuta: Po usunięciu pęcherza moczowego należy szybko wykonać następujące operacje, aby zwiększyć szanse na przeżycie neuronów.
- Dodać roztwór Krebsa do trzech szklanych naczyń i szklanych zlewek.
- Przygotować szklane naczynia i zlewki z roztworem Krebsa w łaźni lodowej w celu wstępnego schłodzenia.
- Oznacz te pojemniki odpowiednio numerami od 1 do 3, aby uniknąć nieporozumień.
- Połącz każde szklane naczynie z kleszczami i rozdzielaczem jąder łyżkowych.
- W szklanym naczyniu 1 rozciąć pęcherz nożyczkami okulistycznymi i rozłożyć go za pomocą kleszczy i rozdzielacza jądra łyżkowego.
- Opłucz pęcherz w szklanej zlewce 1 i umieść go w szklanym naczyniu 2.
- Wyeliminuj przylegający tłuszcz na powierzchni tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek okulistycznych w szklanym naczyniu 2.
- Opłucz pęcherz w szklanej zlewce 2 i umieść go w szklanym naczyniu 3.
- Delikatnie zeskrob pęcherz za pomocą kleszczy i rozdzielacza jądra łyżki na szklane naczynie 3, aby usunąć egzogenne przyczepy.
- Wypłukać pęcherz w szklanej zlewce 3, przenieść pęcherz do 15 ml probówki wirówkowej z 14 ml zimnego roztworu Krebsa i wirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 356 x g i 4 °C.
- Powtórz poprzedni krok dwukrotnie w dwóch innych probówkach z roztworem Krebsa, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.
3. Dwuetapowe trawienie pęcherza moczowego
- Przenieść pęcherz z probówki wirówkowej do fiolki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu wytrawiającego 1. Użyj nożyczek okulistycznych, aby pociąć pęcherz na małe kawałki (mniejsze niż 1 mm) w roztworze.
- Roztwór do pęcherza moczowego zmieszać z 9 ml roztworu trawiącego 1 w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych (średnica 100 mm). Etap 1 mineralizacji w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 godzinę w temperaturze poniżej 5% CO2 w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
- Po etapie 1 mineralizacji odwirować roztwór o sile 356 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut.
- Umieścić roztwór wytrawiający 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu wstępnego podgrzania.
- Po odwirowaniu usunąć sklarowany osad zawierający roztwór trawiący 1 i zebrać osad komórkowy. Dozwolona jest pewna ilość pozostałego płynu. Całkowite usunięcie roztworu może sprzyjać utracie komórek.
- Wymieszać osad komórkowy z ciepłym roztworem wytrawiającym 2 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wstrząsnąć mieszaniną podczas trawienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Nie przekraczaj 7 minut trawienia w kroku 2, w przeciwnym razie neurony zginą.
- Po strawieniu natychmiast dezaktywuj trypsynę w mieszaninie z 10 ml zimnego środka do płukania.
nuta: Wykonaj następujące czynności w temperaturze 0 °C–4 °C. Kąpiel lodowa mogłaby zapewnić takie warunki.
- Zebrać osad komórkowy po odwirowaniu w temperaturze 356 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Usunąć jak najwięcej pożywki, ponieważ pozostała trypsyna szkodzi wzrostowi komórek.
- Delikatnie zawiesić osad za pomocą 3 ml pożywki neuronowej. Upewnij się, że w roztworze zawierającym komórki nie powstają pęcherzyki powietrza, aby zapewnić wysoki wskaźnik przeżycia.
- Przefiltrować pożywkę mieszaniny przez sitko o pojemności 70 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Przechowywać filtrat na wytrząsarce z prędkością 30 obr./min w łaźni lodowej przez 30 minut. Ten krok nie jest konieczny, ale zalecany.
- Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 356 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut i delikatnie zawiesić osady komórkowe w 1 ml pożywki neuronalnej A.
- Dodać 500 μl mieszaniny komórek do każdego dołka przygotowanej płytki 48-dołkowej.
- Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zastąp wszystkie pożywki pożywką neuronową B w ciągu 1 godziny, aby zapewnić posiew wolny od surowicy.
- Zmieniaj połowę pożywki neuronowej B co 3 dni.
nuta: Neurony są gotowe do eksperymentów immunocytochemicznych po 5–7 dniach hodowli.
Tabela 1. Skład roztworu Krebsa
powiedział:
szt.
| składniki | Molarność (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | Pozycja 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | Rozdział 1.2 |
| MgCI2·6H2O | Rozdział 1.2 |
| Certyfikat CaCI2 | Rozdział 2.5 |
| glukoza | Pytanie 11,5 |
