$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie i powlekanie wielokomorowych wiórów
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść chip na szalce Petriego lub innym odpowiednim sterylnym pojemniku.
- Dodać 100 μl roztworu do powlekania wstępnego do lewego górnego dołka wióra i pozwolić mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki.
nuta: Roztwór do wstępnego powlekania służy do wstępnego powlekania kanałów mikroprzepływowych w celu wyeliminowania możliwości uwięzienia pęcherzyków powietrza w chipie.
- Wypełnij lewą dolną studzienkę 100 μl roztworu do wstępnego powlekania. Odczekaj 5 minut, aby roztwór przepłynął przez mikrorowki.
- Dodaj 100 μl roztworu do powlekania wstępnego do prawego górnego dołka i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki. Napełnij prawą dolną studzienkę 100 μl roztworu do wstępnego powlekania.
- Odessać roztwór z każdej studzienki. Zasysać z głównych kanałów, aby uniknąć usuwania płynu z głównych kanałów (Rysunek 1A). Natychmiast dodaj 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do lewego górnego dołka. Czekamy 1.5 min.
ostrożność: Nie zasysaj całej cieczy z zamkniętych kanałów głównych.
- Dodaj 150 μl PBS do lewego dolnego dołka. Odczekaj 5 minut, aby płyny mogły przepłynąć przez mikrorowki. Dodaj 150 μl PBS do prawego górnego dołka. Dodaj 150 μl PBS do prawego dolnego dołka. Odczekaj 10 min.
- Powtórz kroki 1.5-1.6 dla drugiego prania PBS.
- Sprawdź chip pod mikroskopem hodowli tkankowej pod kątem pęcherzyków w głównych kanałach. Jeśli obecne są bąbelki, wykonaj poniższe procedury. Jeśli nie ma żadnych pęcherzyków, przejdź do kroku 1.9.
- Zassać PBS ze studzienek, odchylając końcówkę pipety od otworu kanału (Rysunek 1A).
- Dozować 100 μl roztworu do wstępnego powlekania do górnej studzienki, ustawiając końcówkę pipety pod kątem w pobliżu otworu kanału (Rysunek 1B). Bąbelki powinny przemieszczać się przez kanał do dolnej studzienki. Odczekaj 1.5 min.
- Powtórz kroki 1.3-1.8.
- Zassać PBS ze studzienek, odchylając końcówkę pipety od otworu kanału (Rysunek 1A).
- Dodaj 100 μl 0,5 mg/ml poli-d-lizyny (PDL) do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Napełnij lewą dolną studzienkę 100 μl PDL.
- Dodaj 100 μl PDL do prawego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Dodaj 100 μl do prawego dolnego dołka.
- Zamknąć szalkę Petriego i umieścić chip w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
- Powtórz kroki mycia PBS 1.5-1.6 dwa razy, aby usunąć nadmiar PDL.
- Odessać PBS z urządzenia.
- Natychmiast dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj 1.5 min. Dodaj multimedia w lewym dolnym rogu. Dodaj multimedia w prawym górnym rogu. Odczekaj 1.5 min. Dodaj 100 μl pożywki do prawego dolnego dołka chipa.
- Umieść chip w inkubatorze w temperaturze 37°C, aż będzie gotowy do płytki komórek.
2. Umieszczanie neuronów w wielokomorowych układach
scalonych
- Przygotuj zawiesinę komórkową zdysocjowanych neuronów hipokampa szczura zgodnie z ustalonymi protokołami, aby uzyskać gęstość ~12 × 106 komórek/ml.
nuta: Możliwe jest stosowanie gęstości zawiesiny komórek od 3 do 12 × 106 komórek/ml. Jeśli stosowana jest mniejsza gęstość, objętość zawiesiny komórek, która ma zostać dodana do chipa, może zostać zwiększona. Opisana poniżej procedura ma zastosowanie do mysich zdysocjowanych neuronów korowych lub hipokampa. Optymalna gęstość komórek dla innych typów neuronów może się różnić.
- Usuń większość pożywki z każdej studzienki chipa, pozostawiając około 5 μl w każdym dołku. Zasysać z głównych kanałów, aby uniknąć usuwania cieczy z głównych kanałów (Rysunek 1A).
ostrożność: Nie zasysaj cieczy z zamkniętych kanałów głównych. Pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione w chipie, jeśli płyn zostanie zasysany z głównych kanałów.
- Załaduj 5 μl zawiesiny komórek do prawego górnego dołka i kolejne 5 μl zawiesiny komórek do prawego dolnego dołka (łącznie ~120 000 komórek). Załaduj ogniwa, dozując je blisko głównego kanału (Rysunek 1B). Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że neurony znajdują się w głównym kanale. Odczekaj 5 minut, aby umożliwić przyłączenie się komórek.
nuta: Neurony mogą być ładowane do dowolnej komory. Dla celów wyjaśnienia, przedział somatyczny jest głównym kanałem po prawej stronie, ale każdy przedział może być używany jako przedział somatyczny. Możliwe jest zastosowanie mniejszej gęstości komórek do 60 000 komórek na chip. Do każdej studzienki kompartmentu somatycznego można dodać do 10 μl zawiesiny komórkowej w połączeniu z zawiesiną komórkową zawierającą mniej komórek niż opisano powyżej.
- Dodaj około 150 μl pożywki do hodowli neuronów do każdej z górnych i dolnych prawych studzienek, a następnie dodaj 150 μl pożywki do każdej górnej i dolnej lewej studzienki. Umieść wióry w nawilżonej tacy w inkubatorze o temperaturze 5% CO2 37 °C.
- Po 24 godzinach należy dokonać wymiany pożywki, usuwając pożywkę z dołków. Upewnij się, że główny kanał pozostaje wypełniony. Dodaj 150 μl pożywki do każdej górnej studzienki, a następnie napełnij dolne studzienki.
- Umieść chip z powrotem w inkubatorze na żądaną liczbę dni.
nuta: Monitoruj nośnik co kilka dni, aby upewnić się, że pozostaje jasnoróżowy. Jeśli podłoże jest żółtawe, zastąp 50% go świeżym podłożem. Jeśli poziom płynu jest niski, należy zapewnić odpowiednią wilgotność i odpowiednią wtórną ochronę wiórów, aby zapobiec parowaniu. Zminimalizowanie lub wyeliminowanie zmian w pożywce jest możliwe dzięki wtórnemu zabezpieczeniu i/lub przykryciu naczynia zawierającego wiór folią z politetrafluoroetylenu (PTFE)-FEP.
