Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotuj rozwiązania do eksperymentów
- Przygotować roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (patrz tabela materiałów): Rozmrozić mieszankę ECM na lodzie. Rozcieńczyć mieszaninę ECM w stosunku 1:10 w podstawowej pożywce hodowlanej (bez czynników neurotroficznych lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i przechowywać na lodzie.
- Przygotować pożywkę hodowlaną (patrz tabela materiałów): Przygotować zapas pożywki neuropodstawowej niezawierającej FBS lub neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF). Uzupełnij pożywkę neurobazalną świeżymi FBS (10%) i BDNF (5 ng/ml) tuż przed dodaniem do hodowli komórkowej.
- Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy (patrz tabela materiałów).
2. Mycie i sterylizacja MEA
UWAGA: MEA użyte do eksperymentów zawierają 68 elektrod ułożonych w prostokątną siatkę (Rysunek 1E). Każda elektroda ma wymiary 40 x 40 μm2 w odstępie 200 μm od środka do środka. Elektrody wykonane są z platyny. Elektrody są połączone z odpowiednimi stykami za pomocą obwodu wykonanego z tlenku indu i cyny. Obwód ten jest izolowany warstwą SU-8 o grubości 5 μm. Szczegółowe informacje na temat dostawcy można znaleźć w tabeli materiałów. Inne układy MEA mogą być odpowiednie dla tych eksperymentów.
- Dla nowych MEA: Opłucz je, zanurzając w 70% etanolu na 30 sekund i myj wodą destylowaną przez 30 sekund. Pracuj w okapie z przepływem laminarnym.
- Pozostaw MEA do wyschnięcia na 30 minut w okapie z przepływem laminarnym.
- Umieścić każdy MEA na indywidualnej sterylnej szalce Petriego (35 mm x 10 mm) i zamknąć folią. MEA mogą być przechowywane do czasu ich wykorzystania.
- Dla stosowanych MEA: Inkubować MEA na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) zawierającej 1 ml roztworu enzymatycznego (patrz tablica materiałów) O/N na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej w celu usunięcia materiału biologicznego. Następnie kontynuuj jak w kroku 2.1.
nuta: Z MEA należy obchodzić się ostrożnie, używając kleszczy z gumowymi końcówkami.
3. Przygotowanie MEA do eksperymentów kulturowych
- Usunąć folię uszczelniającą i pozostawić MEA na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) na cały czas trwania eksperymentu.
- Pokryć MEA roztworem przygotowanym w ppkt. 1.1: Za pomocą zimnej końcówki pipety o pojemności 200 μl (przechowywanej w temperaturze -20 °C) nanieść 50 μl roztworu powlekającego do każdej MEA, pokrywając cały obszar elektrody.
- Pozostaw MEA do powlekania przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej.
- Usunąć roztwór powlekający za pomocą pipety. Nałożyć 100 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS i 5ng/ml BDNF i pozostawić w temperaturze pokojowej do momentu posiewu tkanki.
- Umieścić 2 szalki Petriego zawierające pokryte MEA na dużej szalce Petriego (94 mm x 16 mm) i dodać trzecią małą szalkę Petriego zawierającą 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do nawilżania.
nuta: Dodanie małej płytki Petriego (krok 3.5) zawierającej PBS ma kluczowe znaczenie dla znacznego zminimalizowania parowania pożywki hodowlanej.
4. Rozwarstwienie spiralnego zwoju
UWAGA: Grube rozbiory można przeprowadzić poza okapem z przepływem laminarnym (Krok 4.1 do 4.4). W przypadku drobnego rozwarstwienia obowiązkowe są warunki sterylne (okap z przepływem laminarnym) (od kroku 4.5).
- Eutanazja zwierząt (5-7 dniowych myszy) przez dekapitację bez wcześniejszego znieczulenia.
- Wysterylizuj głowę, spryskując ją 70% etanolem.
- Trzymając się za głowę, przetnij połączenie między skórą a czaszką ostrym/ostrym nożyczkiem wzdłuż linii strzałkowej.
- Przetnij czaszkę strzałkowo i usuń mózg za pomocą ostrych/nożyczek.
- Wytnij kości skroniowe z czaszki i umieść je na szalce Petriego zawierającej sterylny, lodowaty roztwór soli Hanksa (HBSS).
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wypreparuj pęcherz bębenkowy za pomocą cienkich kleszczy i odizoluj ucho wewnętrzne.
- Usuń kość ślimaka za pomocą cienkich kleszczy.
- Usuń więzadło spiralne i prążk naczyniowy (SV) razem, przytrzymując kleszczami podstawową część zwoju spiralnego (SG) i SV i powoli rozwijając SV od podstawy do wierzchołka
- Wyizoluj narząd Cortiego (OC), SG i modiolus (ryc. 1A-C).
- Oddziel OC od SG i modiolus, przytrzymując kleszczami podstawową część SG i OC i powoli rozwijając OC od podstawy do wierzchołka.
- Wyciąć boczne eksplantaty (o średnicy od 200 do 500 μm) ze spiralnego zwoju nadal przymocowanego do modiolusa (ryc. 1D) za pomocą kleszczy i mikroskalpela.
5. Hodowla eksplantatów zwojów spiralnych na MEA
- Umieścić dwa eksplantaty spiralnych zwojów obok elektrod na MEA uprzednio przygotowanym ze 100 μl pożywki hodowlanej.
- Umieść narząd Cortiego w odległości około 5 mm od obszaru elektrody.
- Użyj kleszczy, aby przypiąć eksplantaty i narząd Cortiego do MEA, unikając uszkodzenia tkanki.
- Ostrożnie umieścić MEA w inkubatorze i hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia sprawdź wzrokowo, czy eksplantaty są przymocowane do MEA.
nuta: Jeśli eksplantaty nie przyczepiły O/N, rzadko będą to robić w ciągu najbliższych kilku dni. OC umieszcza się w sąsiedztwie kultury w celu wsparcia troficznego/neurotroficznego.
- Dodawaj 100 μl pożywki zawierającej 10% FBS i BDNF codziennie przez 5 kolejnych dni.
- W 6 dniu dodać 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i 5 ng/ml BDNF i hodować tkankę przez dodatkowe 13 dni.
