1. Zasiewanie astrocytów w celu przeprogramowania
UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego o poziomie bezpieczeństwa 1 (SL1).
- Przygotować 24-dołkowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi ze szkła pokrytego poli-D-lizyną w taki sam sposób, w jaki wcześniej przygotowywano kolby hodowlane. Aby określić liczbę potrzebnych płytek, weź pod uwagę, że astrocyty są posiane z gęstością 5-5,5 x 104 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce. Zwykle wyizolowanie sześciu rdzeni kręgowych od myszy po urodzeniu w 2. dniu (P2) daje około 1 x 106 komórek.
- Odessać pożywkę z kolb hodowlanych T25 zawierających hodowane astrocyty i przemyć raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Odłączyć astrocyty od kolby hodowlanej, dodając 0,5 ml 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Delikatnie postukaj w bok kolby, aby uwolnić komórki z powierzchni kolby hodowlanej i sprawdź oderwanie pod mikroskopem jasnego pola przy użyciu 10-krotnego powiększenia.
- Przerwij trypsynizację za pomocą 2,5 ml pożywki do hodowli astrocytów i zbierz zawiesinę komórek w probówkach o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, odsysać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do hodowli astrocytów. Oblicz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
- W zależności od liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek świeżą pożywką astrocytów, aby uzyskać roztwór 1-1,1 x 105 komórek na ml. Uzupełnij pożywkę w naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) w stężeniu 10 ng/ml na czynnik. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej, co odpowiada 5-5,5 x 104 komórek, do każdej studzienki z wcześniej przygotowanych 24-dołkowych płytek i komórek hodowlanych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
2. Wymuszona ekspresja czynników transkrypcyjnych
UWAGA: Przed przystąpieniem do protokołu konieczne jest prawidłowe zaprojektowanie eksperymentu. W szczególności ważne jest, aby zawsze uwzględniać kontrolę ujemną dla przeprogramowania, a mianowicie stan, w którym nie wyraża się czynnika przeprogramowania. Na przykład w przypadku stosowania wektorów przenoszących cDNA jako czynnika przeprogramowującego i reportera (np. białka zielonej fluorescencji (GFP), DsRed), kontrola negatywna jest reprezentowana przez ten sam wektor przenoszący tylko reporter. W przypadku wyrażania wielu czynników, w których występują różne osoby zgłaszające, kontrola ujemna powinna być odpowiednio dostosowana.
- Dzień po posiewie należy sprawdzić płytki 24-dołkowe, aby upewnić się, że komórki przylegają do szkiełek nakrywkowych.
- W oparciu o cel eksperymentalny i dostępne zasoby, wymuszoną ekspresję czynników przeprogramowujących można osiągnąć poprzez transdukcję wirusa (patrz krok 2.3) lub transfekcję DNA (patrz krok 2.4).
UWAGA: Stosowanie retrowirusa lub lentiwirusa wymaga zgody organów rządowych i musi być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa 2 (SL2).
- Przeprogramuj astrocyty, transdukując komórki za pomocą retrowirusa lub lentiwirusa przenoszącego informację genetyczną w celu ekspresji interesującego czynnika (czynników) przeprogramowania, jak opisano poniżej.
- Transdukuj komórki o wysokim mianie wirusa 1 x 1010-1 x 1012 cząstek/ml, dodając 1 μl zawiesiny komórkowej bezpośrednio do pożywki astrocytów. Zapewnia to wysoki wskaźnik infekcji. Hodować komórki za pomocą pożywki astrocytów zawierającej cząstki wirusa w temperaturze 37 °C przez 24-36 godzin przed przystąpieniem do sekcji 3, w zależności od celu doświadczenia.
UWAGA: Różne promotory mogą być używane do kierowania ekspresją transgenów (patrz również Reprezentatywne wyniki). Konstytutywne promotory {np. wirus cytomegalii (CMV), β-aktyna (CAG)} indukują ekspresję transgenu wcześniej niż indukowalne promotory; Jednak oba typy promotorów zostały z powodzeniem wykorzystane do przeprogramowania komórek w neurony.
- Plazmidy DNA mogą być również wprowadzane do astrocytów poprzez transfekcję DNA, jak opisano poniżej.
UWAGA: Można to zrobić pod szafą bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzoną dla SL1.
- Przed transfekcją należy uzyskać odczynnik do transfekcji, plazmidowe DNA pożądanych konstruktów, świeżą pożywkę astrocytów i pożywkę zredukowaną surowicą (patrz Tabela materiałów). Obliczyć wymaganą ilość pożywki o obniżonej zawartości surowicy (patrz Tabela materiałów), biorąc pod uwagę, że każda studzienka na 24-dołkowej płytce wymaga 300 μl pożywki o obniżonej zawartości surowicy. Dodaj odpowiednią ilość pożywki o obniżonej zawartości surowicy do probówki o pojemności 50 ml i podgrzej ją do temperatury 37 °C.
- Gdy pożywka o obniżonej zawartości surowicy jest ciepła, odessać pożywkę astrocytów ze wszystkich studzienek i zebrać ją w probówce o pojemności 50 ml. Przefiltruj zebrane podłoże astrocytów za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μM, aby usunąć oderwane komórki.
- Dodać równą objętość świeżej pożywki astrocytowej do przefiltrowanej pożywki, aby uzyskać roztwór wystarczający do dodania 1 ml pożywki astrocytowej na studzienkę. Utrzymywać pożywkę kondycjonowaną przez astrocyty w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu użycia (krok 2.4.9).
UWAGA: Pożywka hodowlana jest ponownie używana, ponieważ zawiera kilka wydzielanych czynników, które wspierają żywotność kultury.
- Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki o obniżonej surowicy do każdego dołka i umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze.
- Przygotować roztwór A, składający się z DNA i pożywki zredukowanej w surowicy. Do każdego dołka użyj łącznie 0,6 μg DNA i dodaj go do 50 μl pożywki o obniżonej surowicy. Roztwór A należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
UWAGA: Zazwyczaj rozważana jest techniczna trójka dla każdego warunku. W związku z tym przygotowuje się mieszaninę wystarczającą do 3,5 reakcji (np. 2,1 μg całkowitego DNA rozcieńczonego w 175 μl pożywki zredukowanej surowicą), aby zapewnić wystarczającą ilość materiału do transfekcji trzech dołków 24-dołkowej płytki.
- Przygotować roztwór B składający się z odczynnika do transfekcji i pożywki zredukowanej w surowicy. Do każdego dołka dodać 0,75 μl odczynnika do transfekcji do 50 μl pożywki zredukowanej w surowicy. Ponieważ to rozwiązanie jest wspólne dla wszystkich warunków transfekcji, należy je przygotować luzem, aby zmniejszyć zmienność między transfekcjami.
- Inkubować roztwór B w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodaj roztwór B do roztworu A kropla po kropli w stosunku 1:1 i delikatnie wymieszaj. Nie wirować. Inkubować roztwór A+B przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej pod maską.
- Powtórzyć kroki 2.4.5-2.4.7 dla wszystkich warunków transfekcji. Po 20-30 minutach dodać roztwór A+B do każdej studzienki kropla po kropli, aby uzyskać końcową objętość 100 μl. Delikatnie wstrząsnąć płytką i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 4 godziny.
- Po 4 godzinach usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki kondycjonowanej astrocytami, przygotowanej w kroku 2.4.3. Utrzymuj komórki przez 36-48 godzin przed przystąpieniem do sekcji 3, w zależności od celu eksperymentu.
3. Przeprogramowanie astrocytów (analiza 7 dni)
- Przygotować pożywkę różnicującą neurony, dodając 1 ml suplementu witaminy B27 do 49 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Po 24-48 godzinach, w zależności od tego, czy komórki zostały transdukowane, czy transfekowane (patrz odpowiednio kroki 2.3 i 2.4), zastąp pożywkę astrocytów 1 ml pożywki różnicującej neurony na studzienkę i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 9% CO2.
UWAGA: Komórki mogą być również utrzymywane na poziomie 5% CO2, jeśli nie jest dostępny inkubator 9% CO2. Jednak przeprogramowanie neuronów jest bardziej efektywne w tych warunkach.
- Opcjonalnie: Aby zwiększyć wydajność przeprogramowywania, należy uzupełnić pożywkę różnicowania neuronów forskoliną (końcowe stężenie 30 μM) i Dorsomorfiną (końcowe stężenie 1 μM) podczas wymiany pożywki astrocytów na pożywkę różnicującą. Decydując się na leczenie komórek forskoliną i dorsomorfiną, należy podać drugą dawkę Dorsomorphin 2 dni po początkowym leczeniu. Dodaj ten drugi zabieg bezpośrednio do pożywki hodowlanej.
- Bezpośrednie przeprogramowanie mysich astrocytów w komórki neuronalne zwykle następuje w ciągu 7 dni po zmianie pożywki (Rysunek 1). W związku z tym 7 dni po rozpoczęciu przeprogramowania neuronów napraw lub zbierz komórki do dalszej analizy.
