$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Usunięcie mózgu z nienaruszonym korzeniem nerwu słuchowego do stymulacji
UWAGA: Myszy do tych eksperymentów uzyskano poprzez skrzyżowanie transgenicznych myszy ChAT-IRES-Cre na tle C57BL/6J z myszami reporterowymi tdTomato (Ai14). Myszy używane do histologii i elektrofizjologii miały początek po usłyszeniu (P14-P23), czyli około P12 u myszy. Neurony wyrażające tdTomato w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego (VNTB) zostały wcześniej scharakteryzowane jako neurony przyśrodkowe olivocochlear (MOC) w tej linii myszy.
- Poddać zwierzę eutanazji (np. uduszenie CO2 ) i odciąć głowę zwierzęciu przy użyciu zatwierdzonych procedur instytucjonalnych.
- Za pomocą żyletki przetnij skórę w linii środkowej czaszki od nosa do tyłu szyi. Oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.
- Za pomocą małych nożyczek wykonaj nacięcie w czaszce przez linię środkową, zaczynając od podstawy (ogonowy koniec w pobliżu rdzenia kręgowego) czaszki i kontynuując w kierunku nosa.
- Na szwie lambda wykonaj nacięcia w czaszce od linii środkowej, bocznie w kierunku ucha po obu stronach. Oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg.
- Zaczynając od końca rostralnego, delikatnie unieś mózg z czaszki za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej lub kleszczy. Przetnij nerw wzrokowy i kontynuuj delikatną pracę mózgu do tyłu, odsłaniając powierzchnię brzuszną.
- Przetnij nerwy trójdzielne, ściskając je cienkimi kleszczami w pobliżu brzusznej powierzchni pnia mózgu.
nuta: Zrób to ostrożnie, ponieważ nerw przedsionkowo-ślimakowy leży tuż poniżej i musi być nienaruszony do ewentualnej stymulacji.
- Umieść preparat na szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym roztworem do krojenia. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie bąbelkuj karbogenem.
- Przytnij nerw twarzowy blisko pnia mózgu i odsłoń nerw przedsionkowo-ślimakowy.
- Za pomocą cienkich kleszczy wepchnij końcówki w otwór, w którym nerw przedsionkowo-ślimakowy wychodzi z czaszki, tak daleko, jak to możliwe, i ściśnij nerw, aby go przeciąć, pozostawiając korzeń nerwowy przyczepiony do pnia mózgu. Powtórz to po drugiej stronie.
- Gdy oba korzenie nerwowe są wolne, usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne z brzusznej powierzchni pnia mózgu w pobliżu ciała trapezu.
- Uwolnij mózg całkowicie od czaszki, ściskając pozostałe nerwy czaszkowe i tkankę łączną, dbając o zachowanie pozostałego rdzenia kręgowego, jeśli to możliwe.
2. Zablokuj i zamontuj mózg na scenie (dysk magnetyczny)
- Przygotuj powierzchnię mózgu do utrwalenia się do etapu, blokując mózg na poziomie skrzyżowania wzrokowego.
- Z powierzchnią brzuszną do góry, ustabilizuj mózg za pomocą narzędzia, aby delikatnie unieruchomić rdzeń kręgowy, aby mózg nie przechylił się podczas następnego kroku.
- Na poziomie skrzyżowania wzrokowego użyj otwartych kleszczy, aby stworzyć płaszczyznę do blokowania mózgu poprzez włożenie przez mózg do dna naczynia. Włóż kleszcze pod kątem około 20° od pionu, tak aby końcówki wychodziły z grzbietowej powierzchni ogonowej mózgu do skrzyżowania wzrokowego.
- Przetnij wzdłuż kleszczy za pomocą żyletki.
- Przyklej mózg do powierzchni sceny.
- Przygotuj mały blok (~1 cm3) 4% agaru dla wsparcia mózgu.
- Umieść małą kroplę kleju na scenie i rozprowadź ją w prostokąt, aby można było przykleić zarówno mózg, jak i blok agaru.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie unieś mózg i delikatnie przetrzyj nadmiar płynu za pomocą krawędzi ręcznika papierowego. Umieść zablokowaną powierzchnię na kleju, powierzchnia brzuszna będzie skierowana w stronę ostrza podczas krojenia.
- Delikatnie dociśnij blok agaru do grzbietowej powierzchni mózgu, aby podeprzeć go podczas krojenia i zapewnić prawidłowe ustawienie mózgu (tj. kąt).
3. Pokrój mózg, aby utworzyć plasterek klina
UWAGA: Przygotuj wycinek mózgu za pomocą wibratomu, który ma korzeń nerwu ślimakowego po grubej stronie i przyśrodkowe neurony olivocochlear (MOC) oraz przyśrodkowe jądro ciała trapezoidalnego (MNTB) po cienkiej stronie.
- Umieść dysk magnetyczny z dołączonym mózgiem na podstawie stolika i umieść go w komorze krojenia tak, aby brzuszna powierzchnia mózgu była skierowana w stronę ostrza.
- Napełnij komorę lodowatym roztworem do krojenia i bąbelkuj karbogenem.
- Opuść ostrze do roztworu i pokrój plastry doogonowo do obszaru zainteresowania, aby upewnić się, że plastry są symetryczne. Jeśli plasterki wydają się asymetryczne, lekko przechyl stół montażowy, aby uzyskać symetrię.
nuta: Prędkości ostrza w zakresie 0,05-0,10 mm/s były skuteczne w krojeniu zdrowych plastrów i mogą się różnić w zależności od wieku zwierzęcia i obszaru mózgu.
- Gdy plastry są symetryczne, przesuń stolik o ~15° (co odpowiada około 3 koncentrycznym pierścieniom na podstawie stolika) w jedną stronę.
nuta: Odsuń scenę od korzenia nerwu słuchowego, który chcesz zachować w wycinku.
- Kontynuuj ostrożne krojenie, aż korzeń nerwu słuchowego znajdzie się blisko powierzchni po jednej stronie, a nerw twarzowy będzie widoczny na powierzchni po drugiej stronie.
- Przesuń stolik z powrotem o 15° do pierwotnej pozycji.
- Odsuń ostrze od tkanki i obróć stage podstawa o 90° tak, aby boczna krawędź cienkiej strony była skierowana w stronę ostrza. Opuść ostrze o kilkaset mikronów, a następnie powoli zbliż ostrze do krawędzi tkanki. Powtarzaj to, aż ostrze dotknie bocznej krawędzi. Opuść ostrze do żądanej grubości cienkiej krawędzi plastra, tutaj dodatkowe dwieście mikronów.
nuta: Powstały plaster ma idealnie grubość ~300 mm na poziomie jądra brzusznego korpusu trapezowego (VNTB) po stronie, po której będzie miało miejsce zaciśnięcie łatki.
- Odsuń ostrze z powrotem od tkanki i obróć podstawę stopnia z powrotem tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana w jego stronę.
- Wykonaj cięcie, które wyznacza powierzchnię rostralną wycinka klina. Przenieś plasterek na kawałek papieru interfejsowego (1 cm2) powierzchnią ogonową w dół. Przenieść plaster do komory inkubacyjnej lub innego odpowiedniego aparatu do inkubacji w celu odzysku (30 min w temperaturze 35 °C).
nuta: Nerw twarzowy powinien być widoczny na obu półkulach wycinka na powierzchni rostralnej (patrz ryc. 1B).
