Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Abstract

Źródło: Fischl, M. J. et al., In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity.J. Vis. Exp.(2020)

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Usunięcie mózgu z nienaruszonym korzeniem nerwu słuchowego do stymulacji

UWAGA: Myszy do tych eksperymentów uzyskano poprzez skrzyżowanie transgenicznych myszy ChAT-IRES-Cre na tle C57BL/6J z myszami reporterowymi tdTomato (Ai14). Myszy używane do histologii i elektrofizjologii miały początek po usłyszeniu (P14-P23), czyli około P12 u myszy. Neurony wyrażające tdTomato w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego ....

Results

Rysunek 1: Schemat przekroju klina i przykładowy obraz. (A) Schemat przyśrodkowego obwodu sprzężenia zwrotnego oliwoślimaka. Niebieskie strzałki wskazują aferentną ścieżkę wstępującą do neuronów MOC, a czarne strzałki wskazują zstępującą ścieżkę sprzężenia zwrotnego od neuronów MOC do podstawy zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC). (B) Obraz w jasnym polu wycinka kli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparaty eksperymentalne
Agar w proszku	Fisher Naukowy	BP1423500	4% blok agarowy stosowany do stabilizacji tkanki mózgowej podczas cięcia wibratomowego
AlexaFluor Hydrazyd 488	Invitrogen	A10436	Fluorofor stosowany w roztworze wewnętrznym w celu potwierdzenia udanego plastra neuronu MOC
Waga analityczna	Geneses Scientific (Centra handlowe)	Zobacz materiał AV114	Ważenie chemikaliów
Żyletka obosieczna	Teda Pella	121-6	Ostrze tnące Vibratome
Kwas kynureninowy (5g)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał K3375-5G	Krojenie Dodatek ACSF stosowany w celu zmniejszenia aktywności neuronów podczas sekcji i krojenia w celu poprawy zdrowia tkanek w celu zaciśnięcia łaty
pH-metr	Fisher Scientific (Centra handlowe)	13-620-451	Tester pH roztworu
Plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm X 20 mm	Fisher Scientific (Centra handlowe)	12-556-002	4% przygotowanie agaru
Mieszająca płyta grzewcza	Fisher Scientific (Centra handlowe)	11-500-150	Ogrzewanie do przygotowania 4% agaru
Rozwarstwianie i krojenie
Biocytyna	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Substancja chemiczna stosowana do śledzenia aksonów (sprzężona ze streptawidyną 488)
Mikroskop preparacyjny	Amscope (Przedsiębiorstwo Amscope	Zobacz materiał SM-1BN	Do precyzyjnego preparowania podczas usuwania mózgu
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-20	Narzędzie do preparowania kleszczy drobnoziarnistych
Pęseta ekonomiczna #3	Wskaźnik WPI	501976	Narzędzie do preparowania kleszczy
Szklana szalka Petriego o średnicy 150 mm x wys. 15 mm	Fisher Scientific (Centra handlowe)	08-747E	Naczynie rozwarstwiające
Papier interfejsowy (membrana PCTE 203 x 254 mm 10um)	Thomas Naukowy	1220823	Inkubacja plastrów/aplikacja biocytyny
Leica VT1200S Vibratome	Księga Leica	Numer katalogowy: 1491200S001	Vibratome do cięcia plastrów klinowych
Nożyczki majonezowe	Roboz powiedział:	Złącze RS-6872	Narzędzie do preparowania
Ostrza jednosieczne ze stali węglowej	Fisher Scientific (Centra handlowe)	Numer katalogowy: 12-640	Żyletka do rozwarstwiania
Tarcza próbki, orientująca	Księga Leica	14048142068	Specjalistyczny stolik wibratomisowy zapewniający powtarzalne przechylanie
Spoonula powiedział:	Rybak Sci	Numer katalogowy 14-375-10	Narzędzie do preparowania
Super klej	Nowe jajko	Numer katalogowy: 15187	Służy do klejenia tkanki do etapu wibratomu
Vannas Nożyczki sprężynowe	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91500-09	Narzędzie do preparowania