Stymulowanie różnicowania komórek neuronalnych za pomocą złotych nanoprętów

Streszczenie

Źródło: Paviolo., et al. Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana nanoprętami złota. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje technikę promowania różnicowania neuronów poprzez wystawienie komórek nerwowych na działanie złotych nanoprętów i światła laserowego, które tworzy projekcje komórkowe wspierane przez βIII-tubulinę. Barwienie i obserwacja tubuliny i jądra komórkowego za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej ujawnia wyrostki komórkowe, co wskazuje na skuteczność nanopręcików w różnicowaniu neuronów.

Protokół

1. NG108-15 Hodowla i różnicowanie linii komórek neuronalnych

1. Jako pożywkę do hodowli komórkowych należy przygotować 500 ml sterylnej zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% (w/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% (w/v) L-glutaminy, 1% (w/v) penicyliny/streptomycyny i 0,5% (w/v) amfoterycyny B.
   Uwaga: Suplementy można porcjować, przechowywać w temperaturze -20 °C i dodawać do podłoża w wymaganym dniu. Pożywkę do hodowli komórkowych można przechowywać w lodówce w sterylnym stanie maksymalnie przez 1 miesiąc.
2. Jako pożywkę do różnicowania komórek przygotuj 50 ml sterylnego DMEM zawierającego 1% (w/v) L-glutaminy, 1% (w/v) penicyliny/streptomycyny i 0,5% (w/v) amfoterycyny B.
3. Hodować komórki neuronalne NG108-15 w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych w kolbach T75 wykonanych z polistyrenu w inkubatorze z wilgotną atmosferą (5% CO2 w temperaturze 37 °C). Zwykle nasiona 1,5-2 × 10⁵ komórek w każdej kolbie, aby były gotowe w ciągu 3-4 dni. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co dwa dni.
   Uwaga: Aby zapobiec dryfom genetycznym lub zmienności, nie używaj komórek starszych niż pasaż 21 do eksperymentów.
4. Gdy 70-80% zlewa się w hodowli, zmień pożywkę na ciepłą, świeżą pożywkę do hodowli komórkowych. Mechanicznie odłączyć komórki, delikatnie uderzając w dno kolby zlewającej się. Nie używaj trypsyny.
5. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy sile 600 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml ciepłej pożywki do różnicowania komórek.
6. Nasiona 2 × 10⁴ komórki/^cm2 w 96-dołkowej płytce z polistyrenu do hodowli tkankowej z 200 μl pożywki do różnicowania komórek. Inkubować eksperyment przez 1 dzień w temperaturze 5% CO2 / 37 °C.
7. Dodać między 3,2 × 10⁹ - 4,2 ×^{10 10} cząstek/ml roztworu nanopręta złota (Au NR) w drugim dniu i inkubować go przez dodatkowe 24 godziny. Nie dodawaj cząstek do eksperymentów kontrolnych.
   Uwaga: Jako alternatywną kontrolę do celów porównawczych można zastosować nanocząstki złota (Au NP) o dobrze zróżnicowanej szczytowej długości fali absorpcyjnej, Aby uzyskać bardziej spójne zachowanie komórki, utrzymuj stałą gęstość komórek i nie modyfikuj powierzchni studzienki przed wysiewem komórek.

2. Wzmocnienie wzrostu neurytu

1. Sprzęgnij laser ze światłowodem jednomodowym (apertura numeryczna = 0,13) i zakończ go złączem światłowodowym (złącza FC są wygodne i powszechnie dostępne). Zmierz moc wyjściową lasera za pomocą standardowego miernika mocy. Aby uzyskać najbardziej efektywne wyniki, dopasuj szczytową długość fali lasera do piku rezonansu plazmonów NR.
2. W 3 dniu po inkubacji NR przymocuj złącze FC do studzienki. Napromieniać próbki i kontrole w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w fali ciągłej dla różnych mocy lasera. Pozwól hodowli postępować przez dodatkowe 3 dni w temperaturze 5% CO2 / 37 °C. Powtórz naświetlanie laserowe dla co najmniej 3 niezależnych pomiarów.
   Uwaga: W zależności od zastosowania można wybrać różne czasy naświetlania i częstotliwości impulsów.
3. Scharakteryzuj laser pod względem średnicy wiązki i natężenia promieniowania lasera (W∙cm-2).
   1. W przypadku standardowego światłowodu jednomodowego należy użyć NA = n∙sinθ, gdzie n jest współczynnikiem załamania światła używanego ośrodka, a θ jest półkątem stożka światła wychodzącego ze światłowodu (patrz rysunek 1A). Z trygonometrii r = tanθ∙d, gdzie r jest promieniem wiązki, a d jest odległością między włóknem a próbką. Łącznik FC dopasowuje się do średnicy studzienki, dzięki czemu oświetla próbkę w odległości d = 2,70 ± 0,20 mm. Światło wychodzi z włókna w wodzie (n = 1,33), dając r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. Korzystając z tego ostatniego równania, oblicz promień wiązki laserowej, odpowiadającą jej powierzchnię wiązki oraz średnie natężenie promieniowania lasera (moc lasera podzielona przez powierzchnię wiązki) na celu (patrz przykładowy wykres na rysunku 1B). Wartości te reprezentują średnie natężenie promieniowania na oświetlanym obszarze.
   3. Oceń błędy pomiarów za pomocą ogólnej teorii propagacji błędów.
      Uwaga: Odległość między złączem FC a próbką można zmierzyć na podstawie zdjęć układu eksperymentalnego i obróbki końcowej obrazu przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ).
4. W 5 dniu usuń pożywkę różnicującą komórki z eksperymentów i utrwal próbki 3,7% (v/v) roztworem formaldehydu przez 10 minut, a następnie przesiąknij komórki 0,1% (v/v) Triton X-100 przez 20 minut.
5. Dodać 3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do próbek przez 60 minut, aby zablokować nieprzereagowane miejsca wiązania białek. Oznaczyć próbki na obecność anty-βIII-tubuliny na noc (5 μg/ml w PBS uzupełnionym 1% BSA) w temperaturze 4 °C.
6. Inkubować komórki przez 90 minut w ciemności z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (np. TRITC(tetrametylorodaminą) sprzężonym z mysimi przeciwciałem IgG) przy stężeniu 0,4-2 μg/ml w 1% BSA w PBS. Oznaczyć jądra komórkowe DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol) (0,1 μg/ml w wodzie dejonizowanej) przez 10 min.
   Uwaga: Koniugacja i stężenie przeciwciał mogą się różnić w zależności od protokołu firmy. Próbki należy przemywać PBS dwukrotnie przez 5 minut po każdym etapie barwienia.
7. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej przy użyciu obiektywu o temperaturze co najmniej 20×. Wybierz filtry mikroskopu zgodnie z przeciwciałem wtórnym. Wybierz filtr DAPI (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm), aby uwidocznić jądra komórkowe.
8. Przeanalizuj obrazy, oceniając: i) maksymalną długość neurytu (zapisz długość od czubka neurytu do początku ciała komórki), ii) liczbę neurytów na komórkę neuronalną (zsumuj wszystkie neuryty na komórkę) oraz iii) procent komórek z neurytami (podziel całkowitą liczbę komórek eksprymujących βIII-tubulinę przez całkowitą liczbę komórek z dodatnio wybarwionym jądrem)

Wyniki

Rysunek 1. Układ eksperymentalny światłowodu (A) i średnie natężenie promieniowania lasera w funkcji mocy lasera dla wiązki laserowej o powierzchni wynosi 0,4 mm2 (B). Parametry wiązki to (A): kąt połówkowy maksymalnego stożka światła wychodzącego ze światłowodu (θ), promień wiązki (r) oraz odległość między światłowodem a próbką (d).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Au NR	Sigma Aldrich	716812
Zobacz materiał NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM (DMEM)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D6546
Fcs	Technologie życiowe	10100147
L-glutamina	Sigma Aldrich	Klasa G7513
Penicylina/streptomycyna	Technologie życiowe	15140122
Amfoterycyna B	Technologie życiowe	15290018
Formaldehyd	Sigma Aldrich	F8775
Tryton X-100	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	Zobacz materiał T8532
Bsa	Sigma Aldrich	Certyfikat A2058
Anty-βIII-tubulina	Preparat Promega	Zobacz materiał G7121
Przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z TRITC	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T5393
DAPI (interfejs DAPI)	Invitrogen	Zobacz materiał D1306
Spektrometr UV-Vis	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
Mini wirówka	Eppendorf	Mini obrót
Kąpiel soniczna	Unisonics Polska	Płyta FPX 10D
Inkubator do hodowli komórkowych	Kendro	Komórka Hera 150
Wirówka do hodowli komórkowych	Hettich powiedział:	Rotofix 32A
Dioda laserowa	Technologia optotechniczna	780 nm światłowód jednomodowy - sprzężony LD
Światłowód	Tholabs powiedział:	780 KM
Miernik mocy	Spójne	Kontrola laserowa
ObrazJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Mikroskop epifluorescencyjny	Instrumenty firmy Axon	ImageX-press 5000A
Pbs
Polistyrenowa płytka 96-dołkowa
Stężenie CO2
Kolby T75