Wytwarzanie pierwotnych kultur komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Terzi, A., et al., ROS Live Cell Imaging during Neuronal Development. J. Vis. Exp. (2021)

Film demonstruje metodę hodowli pierwotnych komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego. Zarodki we wczesnym stadium są poddawane sekcji w celu wyizolowania oczu, które są następnie mechanicznie dysocjowane w zawiesinę komórek zwojowych siatkówki. Ta zawiesina komórkowa jest hodowana na szkiełkach nakrywkowych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby ułatwić rozwój aksonów.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Nośniki E2 (1x)
   1. Przygotować roztwory 100 x E2A (500 ml), 500 x E2B (100 ml) i 500 x E2C (100 ml), łącząc wszystkie składniki pokazane w Tabeli 1. Autoklaw roztworów E2A, E2B i E2C. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Dla pożywek 1x E2: Połącz 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B i 1 ml 500x E2C. Doprowadzić objętość do 500 ml sterylną wodą. Dostosuj pH do 7,0-7,5.
   3. Przygotować 50 ml porcji 1x pożywki E2 i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Jednak po rozmrożeniu mogą wystąpić opady. Upewnij się, że wytrącanie się całkowicie rozpuszczone przed użyciem roztworu podstawowego.

Tabela 1: Składniki pożywki 1x E2 do hodowli komórek danio pręgowanego.

rozwiązanie	składnik	kwota	koncentracja
100X E2A (500 ml)
	Zawartość NaCl	43,8 gr	1500 mM
	Kcl	1,88 gr	50 mM
	MgSO4	6 gramów	100 mM
	KH2PO4	1,03 gr	15 mM
	Na2HPO4	0,34 grama	5 mM
500X E2B (100 ml)
	CaCl2	5,5 gr	500 mM
500X E2C (100 ml)
	NaHCO3	3 gramów	350 mM
1X E2 (500 ml)
	100X E2A	5 ml	1X
	500X E2B	1 ml	1X
	500X E2C	1 ml	1X

2. Nośniki E3 (1x)
   1. Rozpuść składniki w 1 l sterylnej wody, jak pokazano w tabeli 2, aby uzyskać 100-krotny bulion. Rozcieńczyć bulion w sterylnej wodzie, aby uzyskać 1x pożywkę E3.
   2. Dodaj 0,2% błękitu metylenowego. Na 20 ml pożywki 1x E3 dodaj 40 μl błękitu metylenowego.

Tabela 2: Składniki 100x pożywki E3 do hodowli zarodków danio pręgowanego.

szt.

składnik	Ilość (g)	Stężenie w zapasie 100X (mM)
Zawartość NaCl	Godzina 29,22	500
Kcl	Pytanie 1,26	17
CaCl2 2H2O	Godzina 4,85	33 Rozdział 33
MgSO4 7H2O	Klasa 8.13	33 Rozdział 33

3. 80x roztwór podstawowy soli fizjologicznej
   1. Połącz wszystkie składniki pokazane w tabeli 3. Dodaj wodę, aby uzyskać 100 ml roztworu. Mieszaj, aż wszystkie składniki się rozpuszczą. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.

Tabela 3: Składniki 80-krotnego roztworu soli do hodowli komórek danio pręgowanego.

pkt.

składnik	Ilość (g)	Stężenie w magazynie (mM)
glukoza	Klasa 1,44	Rozdział 80
Pirogronian sodu	0,44	Rozdział 40
CaCl2 2H2O	0,148	10
HEPESY	6.1	Rozdział 256

4. Pożywka do hodowli komórek danio pręgowanego (ZFCM+)
   1. Połączyć wszystkie składniki pokazane w tabeli 4, aby uzyskać 250 ml pożywki. Dostosuj pH do 7,5. Filtrować media za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 4: Składniki pożywki do hodowli komórek danio pręgowanego z surowicą i antybiotykami.

pkt. pkt.

składnik	Ilość (ml)	Objętość %
Pożywka L-15 (z czerwienią fenolową)	212,75	85,1
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	5	cyfra arabska
Penicylina/Streptomycyna	1	0,4
80-krotny roztwór soli fizjologicznej	Pytanie 3,125	Wydanie orzeczenia 1,25
Woda	Godzina 28 125	Godzina 11.25

2. Pierwotna hodowla komórek zwojowych siatkówki pochodzących z zarodków danio pręgowanego

UWAGA: Wykonaj kroki 2.1 i 2.2 w okapie z przepływem laminarnym.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotuj 4-6 płytek hodowlanych w każdym eksperymencie. Używaj szkiełek nakrywkowych oczyszczonych kwasem (22 x 22 mm kwadrat; grubość 0,16-0,19 mm), które są przechowywane w 100% etanolu.
   2. Usuń jedno szkiełko nakrywkowe z pojemnika do przechowywania za pomocą kleszczy i podpal je, aby usunąć resztki etanolu.
   3. Całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe, umieszczając je pod kątem w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.
   4. Przygotuj roztwór roboczy poli-D-lizyny (PDL) (1x), rozcieńczając 10x zapas (5 mg/ml) w sterylnej wodzie.
   5. Nanieść 100 μl 0,5 mg/ml PDL na środek każdego szkiełka nakrywkowego i unikać rozprowadzania roztworu na krawędziach.
   6. Inkubować PDL na szkiełkach nakrywkowych przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Upewnij się, że PDL nie wysycha.
   7. Umyj PDL trzykrotnie 0.5 ml sterylnej wody. Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia.
   8. Przygotuj roztwór roboczy z lamininą (1x), rozcieńczając 50x bulion (1 mg / ml) w 1x PBS.
   9. Nałóż 100 μl 20 μg/ml lamininy w PBS na środek każdego szkiełka nakrywkowego i unikaj rozprowadzania roztworu na krawędziach.
   10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 2-6 godzin. Unikać wysuszenia roztworu lamininy.
2. Sekcja zarodków i posiewanie RGC
   1. Przygotować i oznaczyć cztery 35-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych i napełnić 4 ml 70% etanolu, "pożywki E2 1", "pożywki E2 2", "pożywki E2 3" w dniu sekcji. Trzymaj naczynia w lodówce do momentu rozwarstwienia.
   2. Gdy zarodki danio pręgowanego są 34 godziny po zapłodnieniu (hpf), wyjmij szalki hodowlane pokryte lamininą z inkubatora i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 0,5 ml 1x PBS.
   3. Po ostatnim umyciu dodaj 4 ml pożywki ZFCM(+) do każdego naczynia hodowlanego i unikaj wysuszania płytki.
   4. Pobierz przygotowane naczynia hodowlane z kroku 2.2.1. Niech zrównoważą się z RT.
   5. Napełnij 4-6 probówek PCR 15 μl pożywki ZFCM(+). Jedna tubka jest potrzebna do przygotowania RGC z 4 oczek, które mają być posiane na jednym szkiełku nakrywkowym.
   6. Pobrać zarodki danio pręgowanego z inkubatora i zanurzyć je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 70% etanolu na 5-10 sekund w celu sterylizacji.
   7. Za pomocą pipety transferowej przenieś zarodki do naczynia E2 Media 1 zawierającego sterylne podłoże E2, aby zmyć nadmiar etanolu.
   8. Przenieś zarodki do szalki E2 Media 2 i usuń ich kosmówkę ostrymi kleszczami.
   9. Przenieś zarodki do końcowej szalki E2 Media 3 w celu przeprowadzenia sekcji.
   10. Za pomocą cienkich kleszczy wypreparuj siatkówki.
   11. Umieść i przytrzymaj zarodki przed ich żółtkiem za pomocą jednego z kleszczy, a drugim kleszczami usuń ogon za woreczkiem żółtkowym.
   12. Chwyć szyję kleszczami i zdejmij głowę, aby wystawić mózg i oczy na działanie mediów E2. Unikaj krojenia woreczka żółtkowego.
   13. Czubkiem cienkich kleszczy delikatnie odsuń oczy od głowy, jednocześnie przytrzymując tkankę czaszki drugimi kleszczami. Trzymaj oczy odizolowane od sąsiednich resztek tkanek.
   14. Przenieść cztery oczka do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM(+).
   15. Delikatnie miareczkować w górę i w dół za pomocą pipety P20 i żółtej końcówki około 45 razy, aby zdysocjować komórki. Unikaj pęcherzyków powietrza.
   16. Przenieść ZFCM(+) ze zdysocjowanymi komórkami do środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz kroki 10-12, aby uzyskać dodatkowe szkiełka nakrywkowe.
   17. Utrzymuj kultury na stole w temperaturze 22 °C na stojaku z pianki polistyrenowej, aby pochłaniać wibracje.
   18. Wykonaj obrazowanie 6-24 godziny po posiewaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie hodowlane 35 mm	Sarstedt	Numer katalogowy: 83-3900
Chlorek wapnia dwuwodny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79-500
Szkło nakrywkowe	Corning	2850-22
Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)	Firma VWR	Numer katalogowy: 25384-094
Surowica bydlęca płodu	ThermoFisher Naukowy	26140087
glukoza	Sigma Aldich	Zobacz materiał G7528
HEPESY	Sigma Aldich	Zobacz materiał H4034
Laminina	ThermoFisher Naukowy	23017-015
Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowej	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Pbs	Hyklon/Fisher Scientific	SH3025601
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher Naukowy	15140122
Poli-D-lizyna (PDL)	Sigma Aldich	Zobacz materiał P7280
Pirogronian sodu	Sigma Aldich	Zobacz materiał P5280
Filtr Steritop 0,22 μm	Milipory	S2GPT05RE

powiedział: powiedział: