1. Wychwyt komórkowych nanocząstek magnetycznych (MNP)
- Przygotuj podstawową pożywkę wzrostową do hodowli komórek PC12, dodając 10% surowicy końskiej (HS), 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki Roswell Park Medical Institute (RPMI) i przefiltruj za pomocą filtra nylonowego 0,22 μm.
- Dodać 1% surowicy końskiej (HS), 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,2% amfoterycyny do pożywki RPMI, aby przygotować pożywkę różnicującą PC12 i przefiltrować za pomocą filtra nylonowego 0,22 μm.
- Hodować komórki w niepoddanej działaniu substancji kolbie hodowlanej z 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej; dodawać 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej do kolby co 2-3 dni i podkulturować komórki po 8 dniach.
- W celu wypobrania komórkowego należy odwirować zawiesinę komórkową w probówce wirówkowej przez 8 minut w temperaturze 200 × g i temperaturze pokojowej, a supernatant należy odrzucić.
- Zawiesić komórki w 3 ml świeżej podstawowej pożywki wzrostowej. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 200 × g i temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 3 ml świeżej pożywki różnicującej.
- Odessaj komórki 10x za pomocą strzykawki i igły, aby rozbić skupiska komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 106 komórek w zwykłym niepowlekanym naczyniu o średnicy 35 mm.
- Dodać do naczynia obliczoną objętość zawiesiny MNP i objętość pożywki różnicującej, aby uzyskać pożądane stężenie MNP i objętość całkowitą. Wymieszaj komórki, MNP i pożywkę różnicującą; inkubować naczynie w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej o stężeniu 200 × g i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki różnicującej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
2. Różnicowanie i wzrost komórek na platformie magnetycznej
- Oczyść wzorzyste podłoże 70% v/v/ etanolem i umieść substrat w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm w kapturze. Umieść duży magnes (~1500 Oersted) pod wzorzystym podłożem na 1 minutę i wyjmij magnes, najpierw przesuwając naczynie w górę i odsuwając go od magnesu, a następnie wyjmij magnes z okapu. Włącz światło ultrafioletowe na 15 minut.
- Pokryj podłoże kolagenem typu 1, rozcieńczając kolagen typu 1 (roztwór z ogona szczura) w stosunku 1:50 w 30% v/v etanolu. Aby pokryć naczynie o średnicy 35 mm, dodaj 20 μl kolagenu do 1 ml 30% etanolu.
- Przykryj naczynie roztworem i poczekaj, aż cały roztwór wyparuje, pozostawiając naczynie odkryte na kilka godzin. Umyć 3x w sterylnym 1x PBS; Szkiełko szklane jest gotowe do wysiewu komórek.
- Zawiesić komórki po wychwycie komórkowym MNP, wysiać10-5 komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i dodać 2 ml pożywki różnicującej. Inkubować kulturę w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po 24 godzinach dodać 1:100 świeżego mysiego β-NGF (końcowe stężenie 50 ng/ml). Odnowić pożywkę różnicującą i dodawać świeżą mysią β-NGF co 2 dni.
