$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie płytek pokrytych matrycą z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC)
- Roztwór matrycy błony podstawnej zakwalifikowanej do hESC (patrz tabela materiałów) należy powoli rozmrażać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2–3 godziny lub przez noc, aby uniknąć tworzenia się żelu.
- Aby przygotować płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, należy rozcieńczyć matrycę w zimnym zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium firmy Dulbecco z F12 (DMEM+F12) do końcowego stężenia 2%. Dobrze wymieszać i pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego roztworu matrycowego.
- Inkubować płytki pokryte matrycą błony podstawnej w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 3 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
nuta: Płytki z matrycą membrany podstawnej można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień przed usunięciem roztworu matrycowego i użyciem płytek.
2. Adaptacja hESC typu kolonii do hodowli pojedynczych komórek hESC
- Aby przejść przez wolne od karmienia kultury hESC typu kolonii H9 (WA09) wyhodowane na matrycy błony podstawnej, należy zassać pożywkę ze studzienek (ryc. 1A).
- Przemyć 1x 1 ml DPBS. Dodać 1 ml roztworu do dyspazy (1 j./ml) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Usuń papę, delikatnie umyj komórki 2 ml DMEM/F12, usuń pożywkę i dodaj 2 ml DMEM/F12 do każdej płytki.
- Delikatnie odłącz kolonie, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować granulki przez 2 minuty przy 370 x g i odessać pożywkę.
- Aby rozdzielić osady komórkowe na pojedyncze komórki, dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek (stężenie 1x, patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć roztwór oddzielający.
- Dodaj świeżą pożywkę mTeSR1 z ludzkim ESC i rozdziel komórki na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
- Aby dostosować hESC typu kolonijnego do hodowli jednokomórkowej, należy umieścić około 1,5–2,0 x 106 hESC w każdym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej w 2 ml mTeSR1 zawierającej 10 μM inhibitora ROCK przez 24 godziny (Figura 1A).
- Po 24 godzinach należy zastąpić pożywkę hESC świeżym mTeSR1 bez inhibitora ROCK i pozwolić hESC rosnąć jako typ jednokomórkowy przez 3 dni. Zmieniaj medium codziennie.
- W 4 dniu, gdy kultury osiągną prawie 100% konfluencję, zdysocjuj komórki w roztworze oddzielającym, a następnie ponownie plateruj, jak opisano w kroku 2.6.
nuta: Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność komórek podczas początkowych 24 godzin hodowli pojedynczych komórek typu hESC.
3. Różnicowanie jednokomórkowych komórek hESC na NPC (Rysunek 2)
- Aby wywołać różnicowanie NPC, należy zdysocjować jednokomórkowe hESC za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml DMEM/F12 i zawiesić komórki metodą delikatnego pipetowania.
- Komórki płytkowe na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o gęstości 2 x 10 5 komórek/studzienkę w 2 ml mTeSR1 zawierającego 10 μM inhibitora ROCK.
- Po 24 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do indukcji neuronalnej (DMEM z 1% B27 minus witamina A) uzupełnioną 1 μM dorsomorfiną i 5 μM SB431542.
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez pierwsze 4 dni indukcji neuronalnej, a następnie codziennie, aż do osiągnięcia konfluencji w 7 dniu (ryc. 2B).
UWAGA: (1) Dorsomorfina hamuje szlak BMP poprzez celowanie w receptory ALK2,3,6, a także hamuje AMPK; SB431542 jest inhibitorem szlaku TGFβ/aktywina poprzez celowanie w ALK5,7. (2) Ten sam protokół został przetestowany z inną linią ESC (WA01), która dała podobne wyniki jak WA09. (3) Generalnie używaliśmy Matrigelu do matrycy błony podstawnej; jednak komórki mogą być hodowane na Geltrex, a następnie różnicowane w NPC z bardzo podobnymi wynikami, na co wskazuje ekspresja kilku markerów NPC (Figura 3D, E). Z lekiem Geltrex należy obchodzić się w taki sam sposób jak z lekiem Matrigel (patrz punkt 1).
