Przygotowanie swobodnie unoszących się kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu

Streszczenie

Źródło: Fernandes, A., et al. Krótkoterminowe swobodnie pływające kultury warstwowe z mózgu dorosłego człowieka. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje technikę przygotowywania swobodnie pływających kultur warstwowych z mózgu dorosłego człowieka. Cienkie plasterki są generowane z części mózgu za pomocą wibratomu. Wycinki te są następnie zawieszane w pożywce hodowlanej uzupełnionej czynnikami wzrostu w celu utrzymania żywotności tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Sterylizacja materiałów

UWAGA: Wszystkie materiały i roztwory muszą być wysterylizowane przed użyciem.

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i wibratomiowy materiał do krojenia (uchwyt noża, krążek próbki, taca buforowa) w suchym piecu sterylizacyjnym przez 4 godziny w temperaturze 180 °C.
2. Sterylizuj materiały lub urządzenia wrażliwe na temperaturę za pomocą promieniowania UV lub gamma.
3. Sterylizuj media i roztwory przez autoklawowanie lub filtrację przez membrany porowe 0,22 μm.

2. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 15-20 ml roztworu transportowego: 50% v/v Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) pH 7,4, 50% v/v podłoże podstawowe do utrzymania pourodzeniowych i dorosłych neuronów mózgowych (tabela materiałów), uzupełnione 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 3 mg/ml glukozy i 33 μg/ml gentamycyny.
   nuta: Roztwór transportowy musi być schłodzony i natleniony (bulgoczący gazem karbogenowym) przez co najmniej 20 minut przed pobraniem próbki.
2. Przygotuj 300 ml roztworu do krojenia (HBSS uzupełniony 10 mM HEPES i 3 mg/ml glukozy) i schłodzić go w zamrażarce do punktu początkowego tworzenia się kryształów.
3. Przygotuj 20 ml pożywki hodowlanej: podstawowej pożywki do utrzymania neuronów mózgowych po urodzeniu i dorosłych (tabela materiałów) uzupełnionej 1% pochodną L-glutaminy (tabela materiałów), 2% suplementem do hodowli neuronalnej (tabela materiałów), 1% penicyliną/streptomycyną i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.

3. Ustawianie urządzenia do krojenia

UWAGA: Ten protokół jest idealnie wykonywany z pomocą kolegi ze względu na logistykę pobierania próbek na sali operacyjnej.

1. W wiadrze z lodem z dodatkiem soli pozostaw roztwór do krojenia pod bulgoczącą mieszanką karbogeniczną (95% O₂, 5% CO_{2 )} przez co najmniej 20 minut przed użyciem.
2. Przygotuj blok 3% agarozy (około 2 cm x 2 cm x 2 cm) i przyklej go do krążka próbki wibratomu, aby stworzyć dodatkowe mechaniczne wsparcie dla próbki tkanki podczas krojenia (ryc. 1E).
3. Ustaw wibratomium do krojenia: grubość przekroju 200 μm, częstotliwość drgań 100 Hz i prędkość krojenia w zakresie 0,5-1,0 mm/s.
4. Zablokuj tackę buforową wibratomu na podstawie wibratomu i dodaj lód, aby utrzymać ją w lodówce przed otrzymaniem roztworu do krojenia i próbki oraz przez całą procedurę krojenia.

4. Pobieranie próbek

UWAGA: W tym protokole, ludzka tkanka kory nowej została pobrana na sali operacyjnej i przetransportowana do laboratorium.

UWAGA: Podczas pracy z próbkami ludzkimi, postępuj zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa ustalonymi przez instytucję.

1. Ustawić aparaturę transportową (rysunek 1C), która składa się z: przenośnej butli z gazem z mieszaniną karbogenu podłączonej do zaworu ciśnienia/strumienia, który kontroluje wydatek gazu, podłączonego do silikonowej rurki łączącej wylot gazu ze zbiornikiem transportowym; naczynia transportowego, zwykle stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z perforowaną pokrywą do wprowadzania gazu, zawierające roztwór transportowy; oraz lód do chłodzenia próbki podczas transportu.
2. Natychmiast pobrać i przetransportować próbkę (rysunek 1B) do laboratorium. Zanurzyć próbkę w zimnym roztworze transportowym (stale bąbelkowanym mieszaniną karbogenu).

5. Krojenie

1. Przenieść próbkę na szalkę Petriego (100 mm x 20 mm) zawierającą roztwór do krojenia i za pomocą precyzyjnych narzędzi chirurgicznych ostrożnie usunąć jak najwięcej pozostałych opon mózgowych z próbki (ryc. 1D).
2. Wybierz najlepszą orientację próbki do produkcji plastrów o szczególnych cechach projektu eksperymentalnego, a za pomocą ostrza skalpela nr 24 przytnij płaską powierzchnię, która będzie podstawą przyklejoną do krążka próbki.
3. Za pomocą jednorazowej plastikowej łyżki i delikatnych pędzli należy zebrać fragment z szalki Petriego i osuszyć nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej (wysuszyć kapilarno i unikać dotykania fragmentu tkanki papierem).
4. Za pomocą kleju superglue przymocuj tkankę do krążka próbki wibratomu, aż mocno przylgnie do dysku i zetknie się z blokiem agarozy (ryc. 1E).
5. Umieść krążek próbki wibratomu (z prawidłowo przymocowaną tkanką) na tacce buforowej wibratomu wypełnionej roztworem do krojenia, który musi bulgotać podczas całego procesu.
6. Zablokuj uchwyt noża na miejscu, gdy żyletka jest mocno zamocowana.
7. Roztwór do krojenia musi pokryć zarówno próbkę, jak i ostrze, a dopiero potem rozpocząć krojenie (Rysunek 1F).
8. Pokrój próbkę w plastry o grubości 200 μm.
   nuta: Chociaż niektóre wibratory tną próbki automatycznie, dokładna obserwacja i drobne korekty prędkości krojenia podczas tego procesu mogą pomóc w uzyskaniu lepszych plastrów. Odrzuć początkowe nieregularne plasterki.
9. Przenieś plastry z tacki buforowej na szalkę Petriego z roztworem do krojenia i przytnij luźne brzegi i nadmiar białej masy do proporcji około 70% kory mózgowej/30% masy białej.

6. Kultura

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze z przepływem laminarnym w sterylnym środowisku.

1. Dodać 600 μl pożywki do hodowli na basenik (na płytce 24-dołkowej) i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze 36 °C i 5% CO₂ przed posiewem plastrów.
2. Ułóż jeden plasterek na studzienkę za pomocą pędzla (Rysunek 1G).
3. Jeśli na płytce znajdują się jakieś niewykorzystane studzienki, napełnij je 400 μl sterylnej wody.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO₂,
   nuta: Pierwsza wymiana podłoża musi być wykonana w ciągu 8-16 godzin po poszyciu, w zależności od wielkości plastra.
5. Uzupełnić 10 ml wcześniej przygotowanej pożywki o 50 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF).
   nuta: W ciągu pierwszych 8-16 godzin plastry inkubuje się w 600 μl pożywki, aby uniknąć niedoboru składników odżywczych i zakwaszenia, ponieważ zużycie pożywki w tej fazie jest przyspieszone. Od następnego kroku objętość pożywki na studzienkę dostosowuje się do 400 μl.
6. Usunąć 333 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i dodać 133 μl świeżej pożywki uzupełnionej BDNF.
7. Powtarzaj proces wymiany pożywki co 24 godziny, zastępując jedną trzecią kondycjonowanej pożywki świeżą pożywką uzupełnioną BDNF.

Wyniki

Rycina 1: Pobieranie, transport, krojenie i hodowla tkanki korowej od dorosłych ludzi. Zabieg rozpoczyna się na sali operacyjnej od pobrania tkanki korowej z lobektomii skroniowej w celu leczenia padaczki farmoopornej (A,B). (C) Fragment tkanki (n = 1) jest natychmiast przenoszony do probówki zawierającej lodowato natlenione podłoże transportowe (patrz poniżej). (D) W laboratorium opony mózgowe są u...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarozy	Sigma Aldrich	Numer katalogowy A9539
Nadsiarczan amonu	Sigma	A3678-25G
Amfoterycyna B	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15290-018
B27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044
BDNF powiedział:	Sigma Aldrich	SRP3014
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A7906
glukoza	Merck	108337
Glutamax (Glutamax)	Gibco (firma Gibco)	Numer telefonu 35050-061
Zrównoważone sole Hanka	Sigma Aldrich	H1387-10X1L
Hepes	Sigma Aldrich	Zobacz materiał H4034
Neuropodstawowy A	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 10888-022
Bufor PBS pH 7,2	Laborclin	590338
Penicylina/Streptomycyna	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P4333
Sprzęt i materiał
Mieszanina karbogeniczna	Białe Martiny		95% O2, 5% CO2
Inkubator emisjiCO2	Naukowy Nowy Brunszwik	CO-24	Inkubacja plastrów 5% CO2, 36ºC
Plastikowa łyżka			Wielkość łyżki deserowej
żyletka	Bic		Chrome Platinum, używany do krojenia za pomocą wibratomu
Ostrze skalpela	Becton Dickinson (BD)	Numer 24	Służy do krojenia tkanki; zalecany ten sam rozmiar lub mniejszy
Klej Superglue (Loctite Super Bonder)	Henkel		Skład: Etilcianoacrilato; kwas 2-propenowy; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-krezol; homopolimer
Wibratomizm	Księga Leica	14047235612 - VT1000S

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: