Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Streszczenie

Źródło: Collins, H. Y., et al., Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje metodę izolowania i hodowli mikrogleju z mózgów szczurów. Polega ona na oddzieleniu mikrogleju od innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych za pomocą płytek pokrytych przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla mikrogleju.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie szalki Petriego do immunopanningu CD11b (Dzień 0)

UWAGA: Przygotuj 1 naczynie immunopanujące na każde 1 - 2 młodociane mózgi szczurów.

1. Dodaj 25 ml 50 ml roztworu Tris pH 9,5 o stężeniu 50 ml na 15-centymetrowej szalce Petriego.
2. Dodaj kozie przeciwciała anty-mysie IgG (łańcuchy H+L) do naczynia, aby uzyskać końcowe stężenie 6 μg/ml. Zakręć płytą, aby równomiernie rozprowadzić.
3. Inkubować naczynie przez 1 - 3 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Trzykrotnie przepłukać naczynia preparatem DPBS++ (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z Ca²⁺ i Mg²⁺), a następnie zastąpić roztworem buforu do płukania zawierającym 1 μg/ml przeciwciała OX42. Pozostaw naczynia na noc w temperaturze pokojowej na płaskiej powierzchni.

2. Pobieranie tkanek (Dzień 1)

UWAGA: Ten protokół powinien zająć ~3 - 4 godziny.

1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie roztwory są sterylne i schłodzone na lodzie. Schłodzić wszystkie narzędzia na lodzie i wysterylizować etanolem przed użyciem.
2. Postępując zgodnie z odpowiednimi procedurami regulacyjnymi, uśmierc młodego szczura laboratoryjnego przez uduszenie dwutlenkiem węgla.
   nuta: Alternatywnie, młodsze zwierzęta mogą być uśmiercane za pomocą śmiertelnej dawki ketaminy/ksylazyny (100 - 200 μl 24 mg/ml ketaminy, 2,4 mg/ml ksylazyny). Ketamina/ksylazyna musi być stosowana, jeśli zwierzęta są w wieku poniżej 14 dni. W przypadku wykorzystania wielu zwierząt należy pobrać tkankę od jednego zwierzęcia i umieścić ją we wstępnie schłodzonym DPBS⁺⁺ na lodzie przed przystąpieniem do kolejnych zwierząt.
3. Uszczypnij tylną łapę i upewnij się, że zwierzę całkowicie nie reaguje, zanim przejdziesz dalej.
4. Przezskórnie perfundować zwierzę za pomocą 10 - 30 ml lodowatego buforu perfuzyjnego za pomocą igły 271/2-G, aż bufor będzie czysty.
   nuta: Objętość bufora perfuzyjnego będzie się różnić w zależności od wielkości/wieku zwierzęcia.
5. Natychmiast po perfuzji usuń głowę zwierzęcia. Wchodząc z rdzenia kręgowego, przetnij kłykieć potyliczny z każdej strony nożyczkami preparacyjnymi, uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Po dokładnym przecięciu każdej strony, przeciąć jedną stronę wzdłuż kości ciemieniowej i czołowej w kierunku kości nosowej. Za pomocą kleszczy ostrożnie odciągnij górną część czaszki, szybko usuń mózg (lub interesujące struktury OUN) i umieść we wstępnie schłodzonym DPBS⁺⁺ na lodzie.
6. Powtórz te czynności dla wszystkich pozostałych zwierząt.
   nuta: Wszystkie kolejne czynności powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w odpowiednich sterylnych warunkach.

3. Dysocjacja mechaniczna (Dzień 1)

1. Po zebraniu wszystkich mózgów, posiekaj jeden mózg na kawałki o wielkości 1 mm³ na szalce Petriego na lodzie za pomocą zimnego ostrza skalpela i przenieś do lodowatego homogenizatora z 5 - 7 ml lodowatego buforu do namaczania. Dysocjuj jeden mózg na raz.
2. Oddziel tkankę za pomocą 10 - 20 delikatnych i niekompletnych pociągnięć za pomocą luźno dopasowanego homogenizatora z odskokiem. Należy uważać, aby nie zgniatać bezpośrednio tkanki na dnie homogenizatora, ale zamiast tego przepchnąć tkankę przez przestrzeń między bokami tłoka a homogenizatorem.
3. Ostrożnie wyjmij tłok, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza. Pozwól, aby słabo zdysocjowane kawałki tkanki osiadły na dnie homogenizatora i przenieś supernatant do nowej schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Zastąp usuniętą objętość świeżym buforem do odmieniania i powtórz kroki 3.2 i 3.3, w sumie przez 3-4 rundy lub do momentu, gdy cała tkanka zostanie zdysocjowana. Powtórz procedurę dla każdego mózgu.

4. Usuwanie mieliny (Dzień 1)

UWAGA: Usuwanie mieliny służy do izolacji mikrogleju od zwierząt starszych niż P12.

1. Zmierz objętość zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml, a następnie dodaj lodowaty bufor do zanurzania, aby dostosować całkowitą objętość do 33,5 ml.
2. Dodać 10 ml buforu do separacji mieliny (MSB) do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Spowoduje to 23% końcowe stężenie MSB w objętości 43,5 ml.
3. Wirować przez 15 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C z powolnym hamowaniem.
   nuta: Zwolnienie wirówki powinno zająć około 1,5 - 2 minut. W ten sposób wytworzy się górna warstwa mieliny i szczątków martwych komórek, nieco mętny supernatant i mniejszy osad, który jest wzbogacony o żywe komórki.
4. Usunąć górną warstwę mieliny/zanieczyszczeń i supernatant za pomocą pipety. Zachowaj ostrożność podczas zdejmowania wierzchniej warstwy, aby upewnić się, że jak najwięcej z niej zostało usunięte.
5. Zawiesić osad komórkowy w 12 ml buforu do płukania. Delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórkową, aby rozbić wszelkie grudki komórek, które mogą pozostać.

5. Immunopanning (Dzień 1)

1. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia lub grudki komórek.
2. Opłucz naczynie do patelni pokryte OX42 trzykrotnie za pomocą DPBS++. Nie pozwól, aby talerz całkowicie wyschł między praniami.
3. Odlej ostatnie płukanie DPBS++ i nałóż przefiltrowaną zawiesinę komórkową na naczynie do garnkowania. Delikatnie zakręć płytką, aby rozprowadzić komórki, a następnie inkubuj płytkę na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby komórki się przykleiły. Nie inkubuj dłużej niż 20 minut, w przeciwnym razie komórki staną się bardzo trudne do odzyskania z naczynia.
4. Opłucz naczynie do patelni DPBS++ 10 razy, aby usunąć nieprzylegające komórki. Mikroglej będzie mocno przymocowany do płytki, więc obracaj płytkę przy każdym płukaniu, aby zapewnić usunięcie innych nieprzylegających komórek.
5. Odlej ostatnie płukanie DPBS⁺⁺ i zastąp 15 ml DPBS++ i 200 μl trypsyny (1,25% roztwór podstawowy).
6. Inkubować naczynie przez ≤10 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO₂ w celu strypsynizacji.
   nuta: Nie kontynuuj dłużej niż 10 minut, w przeciwnym razie mikroglej stanie się trudny do usunięcia.
7. Po 10 minutach trypsynizacji mikroglej nadal będzie przyklejony do płytki. Odlej trypsynę/DPBS⁺⁺ i delikatnie przemyj 2x DPBS⁺⁺, aby usunąć trypsynę, zastąp 12 ml lodowatej pożywki do wzrostu mikrogleju (MGM).
8. Umieść naczynie do patelni na lodzie na 2 minuty, aby osłabić interakcję komórka/podłoże, i upewnij się, że naczynie jest płaskie, aby zapobiec wysychaniu obszarów naczynia do patelni
.
9. Energicznie pipetować za pomocą pipety o pojemności 10 ml i kontrolera pipet na wysokich obrotach, aby odzyskać komórki z naczynia do płukania. Narysuj siatkę o wymiarach 16 x 16 ze strumieniem płynu z pipety, aby spróbować usunąć wszystkie komórki.
10. Sprawdź komórki pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że komórki oderwały się od płytki. Zaznacz miejsca na wierzchu naczynia, w których komórki nadal tkwią, i powtórz pipetowanie w tych obszarach.
11. Zebrać zawiesinę komórek i podwielokrotność 3 - 4 ml supernatantu na 15 ml probówki stożkowej. Wirować przez 15 minut przy 500 x g w 4 °C z powolnym hamowaniem.
    nuta: Wirowanie mikrogleju przez małą objętość pozwala na maksymalny odzysk komórek.
12. Odessać supernatant, pozostawiając 0,5 ml MGM z osadem komórkowym.
13. Ponownie zawieś każdą granulkę w pozostałym MGM i połącz komórki ze wszystkich probówek.
14. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
15. Komórki płytkowe zgodnie z opisem w krokach 6 - 7 w zależności od zastosowania.
16. Komórki hodowlane w temperaturze 37 °C z 10% CO₂,
    nuta: Komórki mogą być hodowane przez okres do 3 - 4 tygodni przy regularnych zmianach pożywki lub jeden tydzień bez zmian pożywki.

6. Punktowe powlekanie płytek do hodowli tkankowych/szkiełek nakrywkowych (Dzień 1)

1. Umieścić 15 μl kolagenowej powłoki dożylnej bezpośrednio w środku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej anionowo/kationową (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO₂ .
2. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru rozcieńczyć komórki do 2,3 x 10⁵/ml w MGM. Odessać plamkę kolagenową dożylnie i natychmiast wprowadzić 15 μl zawiesiny komórkowej do tego miejsca; Da to 3,5 x 10³ komórki/plamkę. Inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C z 10% CO₂ , aby umożliwić komórkom przyleganie, delikatnie dodać 500 μl pożywki wzrostowej (TIC) o równowadze CO₂ TGF-β2 / IL-34 / cholesterolu (TIC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor dorzucania			Receptura: 200 μl 0,4% DNaseI w 50 ml DPBS++ Uwagi: Używaj, gdy jest lodowato
Bufor przesuwania			Receptura: 2 mg/ml peptonu z suchej masy mlecznej w DPBS++
Pożywka wzrostowa mikrogleju (MGM)			Receptura: DMEM/F12 zawiera 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy, 5 μg/ml N-acetylocysteiny, 5 μg/ml insuliny, 100 μg/ml apo-transferyny i 100 ng/ml seleninu sodu Uwagi: Użyj lodowatego MGM, aby usunąć mikroglej z naczynia do immnopanningu.
Kolagenowa powłoka dożylna			Receptura: MGM zawierający 2 μg/ml kolagenu IV
Bufor separacyjny mieliny			Receptura: 9 ml Percoll PLUS, 1 ml 10x PBS bez Ca++ i Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Uwagi: Dobrze wymieszać po dodaniu CaCl2 i MgCl2
trypsyna	Sigma	Zobacz materiał T9935
DMEM/F12	Gibco (firma Gibco)	21041-02
Penicylina/ Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
DMEM (wysoki poziom glukozy)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11960-044
Kolagen IV			Rekonstytucja: 200 μg/ml w PBS Zastosowane stężenie: 1:100 Przechowywanie: -80°C
mysi anty-szczur CD11b monoklonalny (klon OX42)	Bio-Rad	MCA275R	Panoramowanie: 1:1,000; Barwienie: 1:500
TGF-b2/IL-34/Pożywka wzrostowa zawierająca cholesterol (TIC)			Receptura: MGM zawierający ludzkie 2 ng/ml TGF-b2, 100 ng/ml mysiego IL-34, 1,5 μg/ml cholesterolu z wełny owczej, 10 μg/ml siarczanu heparanu, 0,1 μg/ml kwasu oleinowego i 0,001 μg/ml kwasu gondonowego Uwagi: Upewnij się, że dodałeś cholesterol do podłoża podgrzanego do 37 °C i nie dodawaj więcej niż 1,5 μg/ml, bo wytrąci się na zewnątrz. Nie filtruj mediów zawierających cholesterol. Zrównoważ pożywkę TIC z 10% CO2 przez 30 minut - 1 godzinę przed dodaniem do komórek, aby zapewnić optymalne pH.
Percoll PLUS	GE Opieka zdrowotna	Kot# 17-5445-02
Talerze Primaria	Firma VWR	Kot# 62406-456
DNaseI	Worthington	Kot# DPRFS

powiedział: