Artykuł metodologiczny

Przygotowanie wycinków mózgu przy użyciu ochronnej metody odzyskiwania opartej na NMDG

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Ting, J. T. et al. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego N-metylo-D-glukaminy. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje protokół uzyskiwania wycinków mózgu za pomocą metody odzyskiwania ochronnej opartej na N-metylo-D-glukaminie (NMDG). Wypreparowany mózg jest inkubowany w aCSF z NMDG i HEPES w celu zminimalizowania śmierci i uszkodzenia komórek neuronalnych podczas sekcji. Sekcja może zostać zregenerowana w aCSF w celu przywrócenia aktywności komórkowej

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja mózgu i krojenie

  1. Odetnij głowę zwierzęciu. Użyj skalpela, aby otworzyć skórę na głowie i odsłonić czapkę czaszki.
  2. Użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad czapką czaszki i wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach u ogonowej/brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowej/grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej mózgu. Wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery "T" prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej.
    nuta: Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. W szczególności w żadnym momencie nie powinna być stosowana żadna siła ściskająca na sam mózg.
  3. Użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od aspektu rostralno-przyśrodkowego i odklej się z powrotem w kierunku ogonowo-bocznym. Powtórz dla obu stron, aby otworzyć i usunąć grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG-HEPES aCSF. Pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez ~1 min.
  4. Użyj dużej szpatułki, aby wyjąć mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zablokuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.
    nuta: Możliwych jest wiele kątów krojenia. Dokładna metoda blokowania i kąt krojenia będą zależeć od dokładnego regionu mózgu, typu komórki i obwodu, który ma być badany.
  5. Przymocuj blok mózgu do uchwytu próbki za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki na tyle, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą. Zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez ~10 s, aż agaroza zastygnie.
  6. Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Napełnij zbiornik pozostałymi, wstępnie schłodzonymi, natlenionymi NMDG-HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 ml i przenieś kamień bąbelkowy do zbiornika na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
  7. Wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu.
    nuta: Oba ustawienia powinny znajdować się w dolnym zakresie. Aby uzyskać najlepsze wyniki, pojedyncze przejście ramienia ostrza powinno zająć około 20 sekund, a oscylacja powinna wytwarzać bardzo gładki i delikatny dźwięk buczenia bez jawnego brzęczenia.
  8. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 μm (lub innej preferowanej grubości), aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni wycięty; całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut.

2. Zoptymalizowana procedura odzyskiwania ochronnego NMDG

  1. Początkowy etap odzyskiwania NMDG (etap krytyczny): Po zakończeniu procedury krojenia zebrać wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej pipety Pasteura i przenieść je do wstępnie podgrzanej (34 °C) komory początkowego odzyskiwania wypełnionej 150 ml NMDG-HEPES aCSF. Przenieś wszystkie plastry w krótkich odstępach czasu i uruchom stoper, gdy tylko wszystkie plastry zostaną przeniesione do komory odzyskiwania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompresja VF-200Instrumenty precyzyjneVF-200Wibracyjna krajalnica do tkanek (zalecana)
N-metylo-D-glukaminaSigma AldrichZobacz materiał M2004Składnik CSF
chlorek soduSigma AldrichS3014Składnik CSF
Chlorek potasuSigma AldrichZobacz materiał P5405Składnik CSF
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodnySigma Aldrich71505Składnik CSF
Wodorowęglan soduSigma AldrichZobacz materiał S5761Składnik CSF
HEPESYSigma AldrichZobacz materiał H4034Składnik CSF
glukozaSigma AldrichKontroler G7021Składnik CSF
Askorbinian soduSigma AldrichA4034Składnik CSF
TiomocznikSigma AldrichZobacz materiał T8656Składnik CSF
Pirogronian soduSigma AldrichZobacz materiał P5280Składnik CSF
Chlorek wapnia dwuwodnySigma AldrichZobacz materiał C7902Składnik CSF
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma AldrichZobacz materiał M1880Składnik CSF
Zakrzywione kleszczeNarzędzia naukoweNumer katalogowy: 11065-07Narzędzia do preparacji mózgu
Cienkie nożyczki preparacyjne (supercut)Narzędzia naukoweNumer katalogowy: 14058-09Narzędzia do preparacji mózgu
Duże, wytrzymałe nożyce 7''Narzędzia naukoweNumer katalogowy: 14000-18Narzędzia do preparacji mózgu
Metalowa szpatułkaSigma AldrichZ511455-1PAKNarzędzia do preparacji mózgu
ŻyletkiFirma VWRNumer katalogowy: 89031-954Narzędzia do preparacji mózgu
Strażnik Plasterka Mózgu-4Automatyzacja badań naukowychZobacz materiał S-BSK4komora do przechowywania plasterków mózgu
Siatka nylonowaInstrumenty Warnera64-0198Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów
Zlewki ze szkła pyrexowego (250 ml)Firma VWRNumer katalogowy: 89090-434Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów
Talerz plastikowy 35 mm, okrągłyFirma VWRNumer katalogowy: 100488-376Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów
Kamienie dyfuzora gazu (10 μm)Sigma AldrichNumer katalogowy: 59277Do stałego karbonepidu (drobne pęcherzyki)
Agaroza typu I-BSigma AldrichNr kat. A0576Do osadzania próbek mózgu
kwas solnySigma AldrichH1758-100MLDo regulacji pH pożywek
wodorotlenek soduSigma Aldrich221465-25GDo regulacji pH pożywek
Wodorotlenek potasuSigma Aldrich221473Do regulacji pH pożywek
Plastikowe pipety transferowe z podziałką 3 mlFirma VWRNumer katalogowy: 89497-676Do przenoszenia plastrów
Ceramiczne łopatki wtryskiwaczy z cyrkonuOstrza specjalistyczne CadenceEF-INZ10http://cadenceinc.com/
Podgrzewana kąpiel wodna (2,5L)Firma VWRNr kat. 13491-060rozmaity
Krążki bibuły filtracyjnejFirma VWRNumer katalogowy 28456-022rozmaity
Klej cyjanoakrylowyAmazonkaB000BQRBO6rozmaity
Szklana szalka PetriegoFirma VWR89000-326rozmaity
10X sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma AldrichZobacz materiał P5493rozmaity
Termomikser (z blokiem probówek 1,5 ml)Firma VWRNumer katalogowy: 89232-908Aby utrzymać stopioną agarozę
powiedział: (wersja angielska) TGL powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

Powiązane artykuły