1. Sekcja mózgu i krojenie
- Odetnij głowę zwierzęciu. Użyj skalpela, aby otworzyć skórę na głowie i odsłonić czapkę czaszki.
- Użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad czapką czaszki i wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach u ogonowej/brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowej/grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej mózgu. Wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery "T" prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej.
nuta: Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. W szczególności w żadnym momencie nie powinna być stosowana żadna siła ściskająca na sam mózg.
- Użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od aspektu rostralno-przyśrodkowego i odklej się z powrotem w kierunku ogonowo-bocznym. Powtórz dla obu stron, aby otworzyć i usunąć grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG-HEPES aCSF. Pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez ~1 min.
- Użyj dużej szpatułki, aby wyjąć mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zablokuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.
nuta: Możliwych jest wiele kątów krojenia. Dokładna metoda blokowania i kąt krojenia będą zależeć od dokładnego regionu mózgu, typu komórki i obwodu, który ma być badany.
- Przymocuj blok mózgu do uchwytu próbki za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki na tyle, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą. Zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez ~10 s, aż agaroza zastygnie.
- Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Napełnij zbiornik pozostałymi, wstępnie schłodzonymi, natlenionymi NMDG-HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 ml i przenieś kamień bąbelkowy do zbiornika na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
- Wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu.
nuta: Oba ustawienia powinny znajdować się w dolnym zakresie. Aby uzyskać najlepsze wyniki, pojedyncze przejście ramienia ostrza powinno zająć około 20 sekund, a oscylacja powinna wytwarzać bardzo gładki i delikatny dźwięk buczenia bez jawnego brzęczenia.
- Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 μm (lub innej preferowanej grubości), aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni wycięty; całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut.
2. Zoptymalizowana procedura odzyskiwania ochronnego NMDG
- Początkowy etap odzyskiwania NMDG (etap krytyczny): Po zakończeniu procedury krojenia zebrać wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej pipety Pasteura i przenieść je do wstępnie podgrzanej (34 °C) komory początkowego odzyskiwania wypełnionej 150 ml NMDG-HEPES aCSF. Przenieś wszystkie plastry w krótkich odstępach czasu i uruchom stoper, gdy tylko wszystkie plastry zostaną przeniesione do komory odzyskiwania.