Technika przedłużonej inkubacji tkanki neuronalnej siatkówki

Streszczenie

Źródło: Cameron, M. A., et al. Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje metodę długotrwałej inkubacji tkanki neuronalnej siatkówki. Muszle oczne zawierające siatkówkę uzyskuje się z oka myszy; wewnętrzna błona ograniczająca (ILM) jest trawiona enzymatycznie w celu odsłonięcia komórek nerwowych siatkówki, a leczona muszla oczna lub izolowana siatkówka jest przenoszona do specjalistycznego inkubatora w celu przedłużonej inkubacji w niskiej temperaturze.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie całej siatkówki i usunięcie wewnętrznej błony ograniczającej

1. Przygotuj całe cewki siatkówki w normalnych warunkach oświetlenia laboratoryjnego lub w słabym świetle czerwonym/podczerwonym.
2. Poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i natychmiast wyłuszczyć oczy. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż ora serrata i umieść w pożywce Amesa lub sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF) zawierającym (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glukozy, 0,5 L-glutaminy i nasącz karbogenem (95% mieszaniny O₂/5% CO₂; ~300 mOsm; pH 7,4), w temperaturze pokojowej (RT).
3. Natychmiast usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, przecinając wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami i usuwając soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy. Umieścić tkankę w systemie inkubacji w RT.
   nuta: Tkanka siatkówki może być utrzymywana w muszli ocznej, po powolnym obniżeniu temperatury do 15 - 16 °C, przez >24 godziny w systemie inkubacji, aż będzie potrzebna.
4. Aby usunąć ILM, przenieś muszlę oczną zawierającą siatkówkę do małego szklanego słoika zawierającego 30 U/ml papainy, 1 mM L-cystyny, 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,005% deoksyrybonukleazy (DNazy) w zrównoważonym roztworze soli Earla (BSS) w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Nałóż 95% O₂/5% CO₂ na roztwór przez pokrywkę, ale nie bąbelkuj. W przypadku stosowania tkanek pochodzących od młodych zwierząt (<6 tygodni) roztwór należy rozcieńczyć do połowy mocy.
   1. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, umieszczając tkankę w roztworze albuminy ovomukoidu (10 mg/ml) i albuminy surowicy bydlęcej (BSA, 10 mg/ml) na 10 minut w BSS Earla. Przed przeniesieniem do systemu inkubacji dokładnie umyć tkankę płynem mózgowo-rdzeniowym i obniżyć temperaturę do 15 - 16 °C.
5. Utrzymuj tkankę siatkówki w muszli ocznej, aż będzie potrzebna. W celu przeniesienia do mikroskopu odizoluj siatkówkę od muszli ocznej i pokrój na 4 części żyletką. Jeśli wymagana jest cała siatkówka, wykonaj cztery małe nacięcia na obrzeżach siatkówki, aby mogła leżeć płasko.
   nuta: W przypadku eksperymentów obrazowych, przed przeniesieniem do systemu inkubacji należy obciążyć barwnikami wapniowymi, patrz poniżej.

2. Utrzymanie tkanki w inkubatorze

1. Umieść tkankę w głównej komorze zawierającej sondy do pomiarów pH i temperatury (rysunek 1A, B).
2. Cyrkulować CSF przez drugą komorę (komorę UVC, zbudowaną zgodnie z wcześniejszym opisem) odizolowaną od komory głównej i wystawioną na działanie światła ultrafioletowego C (UVC) o mocy 1,1 W (254 nm, lampa UV sterylizatora 5W/2P) w celu wyeliminowania bakterii unoszących się w roztworze (rysunek 1A). Kontroluj czas światła UVC za pomocą programowalnego timera za pomocą losowej funkcji, która włącza się w godzinach wahających się od 15 do 26 minut co 15 - 30 minut, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania się aCSF.
3. Ustaw natężenie przepływu w komorze UVC na 12 ml/min, jak wcześniej podawano. Przykryj komorę UVC folią aluminiową, aby zapobiec świeceniu UVC na zewnątrz komory, które może uszkodzić tkankę neuronalną.
   nuta: W przypadku tkanki siatkówki przystosowanej do ciemności nałóż niestandardową osłonę na główną komorę, aby wykluczyć światło.
4. Za pomocą pompy perystaltycznej należy przeprowadzić cyrkulację roztworu (aCSF) przez dwie komory oraz termoelektrycznej chłodnicy z zimną płytą Peltiera w celu schłodzenia lub ogrzania komory głównej do żądanych temperatur w zakresie 0 - 50 °C. Aby uzyskać optymalną inkubację tkanek, należy stosować temperaturę 15 - 16 °C dla długoterminowej żywotności.

Wyniki

Rysunek 1. System inkubacji, który umożliwia ścisłą regulację środowiska tkankowego. A, Schemat ideowy systemu inkubacji składającego się z chłodzącej płytki Peltiera, komory głównej, pompy perystaltycznej i komory UVC. B, Widok z boku komory głównej pokazujący punkty wlotowe i wylotowe aCSF, a także sondy wlotowe, temperatury i pH karbogenu. Tkankę umieszcza się na siatce zgodnie z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chlorek sodu	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P9333
N-metylo-D-glukamina	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M2004
D-glukoza	Sigma Aldrich	Zobacz materiał G5767
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał S6014
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M9272
Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	223506
System dysocjacji papainy	Worthington	LK003150
Mikroskop pionowy ze stałym stolikiem	Olympus	BX51WI
Obiektyw mikroskopu	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20-krotny
Obiektyw mikroskopu	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60-krotny
Mózgkubator	Payo Naukowy	BR26021976	www.braincubator.com.au
Termoelektryczna chłodnica płytowa Peltiera-ThermoThermal	Technologia TE	CP-121 (szt.)
Regulator temperatury	Technologia TE	TC-36-25 Złącze RS232