1. Przygotowanie materiałów i podłoża hodowlanego
- W celu rozwarstwienia i dysocjacji SCZ (strefy podmodzelowej) owiń macierz mózgu, obosieczną żyletkę i kleszcze folią aluminiową, a następnie wysterylizuj je przez autoklawowanie.
- Przygotuj 50 ml zimnego buforu PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), aby umyć cały mózg myszy.
- Ustaw mikroskop preparacyjny i przygotuj narzędzia chirurgiczne wymagane do wypreparowania mózgu (autoklawowane nożyczki i kleszcze) oraz izolacji SCZ (strzykawka 1 ml, igła 30 G, matryca mózgowa i cienkie kleszcze).
- Przygotowanie podłoża N2:
- Przygotuj pożywkę F-12/DMEM (+L-glutamina, + wodorowęglan sodu) z 2% suplementami B27, 1% N2 i 1% penicyliną-streptomycyną.
Uwaga: Pożywka wzrostowa składa się z pożywki N2 i czynników wzrostu (20 ng/ml oczyszczonego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF2)).
- Przygotować bufor do trawienia (40 jednostek/ml papainy, 2,4 jednostki/ml dypazy II i 2% penicyliny-streptomycyny w PBS) do trawienia tkankowego.
- Przygotowanie płytki powlekającej i szkiełka nakrywkowego:
- Przygotować poli-L-ornitynę (PLO; 0,01%) i lamininę (10 μg/ml rozpuszczoną w DH2O). Aby pokryć płytki 6-dołkowe w celu utrzymania SCZ-aNSC (dorosłych nerwowych komórek macierzystych) jako monowarstwę lub 18 mm szkiełka nakrywkowe do barwienia immunologicznego, należy je inkubować z PLO przez noc w temperaturze 4°C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O. Po ostatnim praniu pozostaw płytki i szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.
- Następnie inkubować płytki z lamininą przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O.
Uwaga: Nie susz lamininy, co wpłynie na przyczepianie komórek.
Uwaga: Roztwory powłokowe mogą być ponownie użyte 3 razy.
2. Izolacja i dysocjacja dorosłego SCZ
- Przed przygotowaniem hodowli umieść macierz mózgową i obosieczną maszynkę do golenia na lodzie.
Uwaga: Nie zamrażaj macierzy mózgowej, ponieważ mózg może się do niej przyłączyć.
- Uświęć mysz (w wieku 8 tygodni) przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy.
- Odetnij głowę ostrymi nożyczkami po rozpyleniu 70% etanolu. Aby unieruchomić głowę, trzymaj mocno obie strony głowy. Przetnij skórę nożyczkami na linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym. Sprzyja to całkowitemu usunięciu skóry z czaszki.
- Najpierw usuń ogonową część czaszki (tylną do lambdy), a następnie włóż kleszcze między czaszkę a mózg w grzbietowej pozycji linii środkowej. Chwyć lewą (lub prawą) kość ciemieniową i ostrożnie ją oderwij. Powtórz tę procedurę w celu usunięcia drugiej kości ciemieniowej.
Uwaga: Odłączenie nerwu wzrokowego i usunięcie opon mózgowych z mózgu ułatwia odłączenie mózgu od czaszki.
- Przenieś mózg do zimnego buforu PBS (25 ml) i przepłucz go dwukrotnie, aby usunąć nadmiar krwi.
- Umieść mózg w macierzy mózgowej na lodzie i wykonaj nacięcia koronalne, aby uzyskać plastry o grubości 1 mm. Przenieś wycinki mózgu (1 mm) zawierające obszary SCZ, które znajdują się w tylnej części mózgu, do zimnego PBS na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
ostrożność: Aby uzyskać równoległą płaszczyznę odcinków koronalnych, upewnij się, że szczelina mózgu znajduje się w linii środkowej macierzy mózgowej; Bardzo ważne jest, aby uniknąć niepotrzebnych zmian w sekcjach.
nuta: Uzyskać plastry mózgu w odległości 2-3 mm za bregmą; pozwala to na oddzielenie SCZ od SVZ (strefa podkomorowa).
- Pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu należy dokonać mikrosekcji SCZ z obszaru istoty białej kory mózgowej i hipokampa za pomocą wygiętej igły 30G6,9. Następnie usuń obszary kory powyżej SCZ. Umieść wycięty obszar SCZ z plastrów na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie bez zimnego PBS.
nuta: Zanieczyszczenie dodatkowych regionów zawierających dojrzałe neurony może wpływać na żywotność aNSC i tworzenie neurosfery, ponieważ ulegają one śmierci komórkowej w warunkach hodowli aNSC.
- Za pomocą wygiętej igły 30 G natychmiast posiekaj wycięte tkanki na małe kawałki.
nuta: Jeśli wypreparowanie tkanki SCZ wymaga dłuższego czasu, przed posiekaniem zanurz wypreparowane tkanki w zimnym PBS.
- Ponownie zawiesić rozdrobnioną tkankę w 1 ml buforu wytrawiającego, przenieść tkankę do 15 ml probówki zawierającej 2 ml buforu wytrawiającego i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
nuta: Wstrząsaj probówką co 10 minut, aby dobrze wymieszać.
3. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej
- Delikatnie postukać w probówkę, aby oddzielić strawioną tkankę, a następnie odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić strawioną tkankę w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki N2 w celu wypłukania buforu wytrawiającego i delikatnie pipetować roztwór próbki maksymalnie 5 razy za pomocą pipety P1000.
nuta: Nadmierne rozcieranie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.
- Odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki N2.
- Przygotować 1 ml pożywki N2 na niepowlekanej płytce 6-dołkowej i dodać 1 ml zawieszonych komórek, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.
- Dodaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij ręcznie 6-dołkową naczynią hodowlaną, aby wymieszać dodane czynniki wzrostu z posianymi komórkami. Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C i 5% CO2 .
- Dodawaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki codziennie przez 8 dni. Co trzeci dzień dodawać 200 μl pożywki N2, aby utrzymać około 2 ml objętości pożywki.
4. Pasaż NSC jako neurosfery i do kultur jednowarstwowych
- Zbierz neurosfery i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
Uwaga: Liczba neurosfer (o średnicy >50 μm) na studzienkę z SCZ pojedynczego mózgu myszy wynosiła 64,3 ± 7,31, czyli mniej niż w SVZ (190,5 ± 6,33).
- Inkubować neurosfery z 0,5 ml buforu dysocjacyjnego przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aby zdysocjować neurosfery na pojedyncze komórki. Pierwotne neurosfery mogą być dysocjowane na pojedyncze komórki i utrzymywane przez kilka przejść jako neurosfery lub kultury jednowarstwowe.
nuta: Rozszerzanie SCZ-aNSC jako monowarstwy jest lepsze od neurosfer, ponieważ SCZ-aNSC mogą być pasażowane >10 razy w formacie kultury jednowarstwowej, ale <5 razy w formacie kultury neurosfery.
ostrożność: SCZ-aNSC wykazują silną agregację i trudno jest je rozdzielić na pojedyncze komórki. W związku z tym format hodowli neurosfery nie jest zalecany do rutynowej ekspansji komórek.
- Delikatnie pipetować roztwór próbki w górę i w dół pipetą P1000 mniej niż 5 razy i odwirować probówkę przy 145 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić neurosfery w 1 ml pożywki N2.
nuta: Nadmierne miareczkowanie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.
- Aby policzyć komórki, należy przygotować mieszaninę 1:1 zawiesiny komórek (10 μl) i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę żywych komórek na hematocytometrze. Po pokryciu 6-dołkowej płytki PLO/lamininą, pokryj komórki w ilości 2,5 x 105 komórek/ml 2 ml pożywki N2 dla każdego dołka.
nuta: Zmiany gęstości komórek mogą wpływać na ich stan i potencjał różnicowania.
- Utrzymuj SCZ-aNSC poprzez codzienne leczenie czynnikami wzrostu (2 ml, 20 ng/ml) przez 5 dni, a następnie je pasuj.
5. Różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej
- Umieścić aNSC na szkiełku nakrywkowym o średnicy 18 mm pokrytym PLO/lamininą z 1 x 105 komórek/ml w 1 ml N2 z czynnikami wzrostu (20 ng/ml) w celu różnicowania SCZ-aNSC.
- Następnego dnia, gdy komórki są mocno przymocowane do szkiełka nakrywkowego, wymień pożywkę wzrostową na N2, aby usunąć czynniki wzrostu.
- Po 6 dniach przemyj zróżnicowane komórki 1 ml PBS, aby usunąć resztki komórek i utrwalić je do barwienia immunologicznego.
Uwaga: BrdU może zostać włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA proliferujących komórek. Dlatego, w razie potrzeby, BrdU (10 μg/ml) można dodać do żywych komórek przed ich utrwaleniem.
