1. Hodowla i przechowywanie ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego
- Utrzymuj ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej (patrz tabela materiałów) w pożywce z komórek śródbłonka okołokomorowego (podłoże E6 zawierające 50 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A [VEGF-A], 100 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 [FGF2] i kwasu gamma-aminomasłowego 5 μM [GABA]) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj medium co drugi dzień.
- Rozmrozić matrycę błony podstawnej w temperaturze 4 °C i przygotować roztwór w stosunku 1:100, rozcieńczając go w zimnym zmodyfikowanym podłożu Eagle i pożywce F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco. Pokryj każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 1 ml roztworu matrycowego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
- Pozwól, aby ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego osiągnęły zbieg 80%-90%. Odessać podłoże ze studni. Umyj studzienki raz 1 ml sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) na studzienkę.
- Odłączyć komórki, dodając 1 ml roztworu do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) do studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach dodać 1 ml pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: Używamy tutaj Accutase do dysocjacji komórek, w przeciwieństwie do TrypLE w sekcjach 3 i 4.
- Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml okołokomorowej pożywki komórkowej śródbłonka.
- Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego. Komórki nasienne na świeżych płytkach pokrytych matrycą o gęstości 1,2 x 105 komórek/cm2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przechowuj ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego przez krioprezerwację w pożywce zamrażającej (90% pożywki dla komórek śródbłonka okołokomorowego i 10% sulfotlenku dimetylu [DMSO]).
- Oddziel i zbierz komórki, wykonując kroki 1.3 i 1.4 powyżej. Policz komórki w roztworze metodą wykluczania błękitu trypanowego.
- Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w temperaturze 5 x 106 komórek/ml pożywki do zamrażania.
- Dozować 1 ml pożywki zamrażającej plus komórki na kriowial. Umieścić fiolki w komorze wypełnionej izopropanolem i schłodzić przez noc w temperaturze -80 °C w temperaturze 1 °C/min. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
2. Przygotowanie ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego do oznaczania
- Pozwól ludzkim komórkom śródbłonka okołokomorowego osiągnąć zbieżność 70%-80%.
- Dysocjuj komórki, wykonując kroki od 1.3 do 1.5, jak opisano powyżej. Policz komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.
3. Przygotowanie ludzkich interneuronów GABA-ergicznych do testu
UWAGA: Interneurony GABA-ergiczne pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oraz pożywka neuronalna zostały zakupione komercyjnie (patrz Tabela Materiałów). Neurony są generowane przez różnicowanie linii iPSC pochodzącej z ludzkich fibroblastów zgodnie z protokołem opracowanym przez producenta. Komórki zostały rozmrożone i wyhodowane zgodnie z protokołem producenta.
- Rozmrozić ludzkie interneurony GABA-ergiczne i hodować je na 12-dołkowej płytce przez dwa tygodnie do konfluencji 70%-80%.
- W dniu przeprowadzenia testu należy sporządzić ciepły roztwór do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) i podwielokrotność pożywki neuronalnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut przed użyciem.
- Odessać pożywkę z każdej studzienki zawierającej komórki. Umyj komórki 1 ml sterylnego 1x PBS na studzienkę.
- Odłączyć komórki, dodając 0,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu dysocjacyjnego do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki neuronalnej na studzienkę. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie rozcierać, aby dysocjować grudki komórek.
- Odwirować komórki przy 380 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki neuronalnej. Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.
4. Przygotowanie kontrolnych komórek śródbłonka ludzkiego do badania
UWAGA: Kontrolne ludzkie komórki śródbłonka pochodzące z iPSC oraz pożywka dla komórek śródbłonka zostały zakupione komercyjnie (Tabela materiałów). Te komórki śródbłonka są generowane przez różnicowanie linii iPSC pochodzącej z ludzkich fibroblastów do losu śródbłonka zgodnie z protokołem opracowanym przez producenta. Komórki rozmrożono i wyhodowano na podłożu fibronektyny zgodnie z protokołem producenta. Płytki pokryte fibronektyną zostały przygotowane zgodnie z protokołem producenta.
- Rozmrozić kontrolować ludzkie komórki śródbłonka i hodować je na 6-dołkowej płytce do zbiegu 80%-90%.
- W dniu wykonania testu należy sporządzić ciepły roztwór do dysocjacji komórek (zob. tabela materiałów) i podwielokrotność podłoża śródbłonka w temperaturze 37 °C przez 10 minut przed użyciem.
- Odessać pożywkę z każdej studzienki zawierającej komórki. Umyj komórki 1 ml sterylnego 1x PBS na studzienkę.
- Odłącz komórki, dodając 0,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki z komórek śródbłonka na studzienkę, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórek śródbłonka. Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.
5. Przygotowanie wkładek do hodowli jednodołkowych
- Rozmrozić 1 mg/ml roztworu lamininy w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Pokryj odpowiednią liczbę szalek o średnicy 35 mm 0,01% roztworem poli-L-ornityny (1 ml na miskę). Inkubować naczynia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
- Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu lamininy w stosunku 1:300 w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 3,3 μg/ml.
- Całkowicie odessać poli-L-ornitynę z każdego naczynia. Dokładnie spłucz każde naczynie 3x sterylną wodą i całkowicie odessać, aby uniknąć toksyczności komórkowej wywołanej poli-L-ornityną.
- Dodać 1 ml 3,3 μg/ml roztworu lamininy do każdego naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc lub co najmniej 1 godzinę. Usunąć roztwór lamininy z naczynia bezpośrednio przed użyciem.
nuta: Alternatywnie, należy przechowywać szalki zawierające lamininę w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C.
- Wytnij trzy boki jednego dołka dwudołkowej silikonowej wkładki hodowlanej (Rysunek 1A) za pomocą sterylnego ostrza, aby wygenerować wkładkę jednodołkową (Rysunek 1B).
nuta: Podczas cięcia utrzymuj wkładkę dwudołkową mocno przymocowaną do powierzchni oryginalnego opakowania, aby zapewnić gładkie cięcie i chronić przyczepność wkładki.
- Odessać roztwór lamininy z naczyń.
nuta: Nie myj naczyń sterylnym PBS lub wodą po inkubacji lamininy. Wilgotne powierzchnie zapobiegną szczelnemu przyleganiu wkładki hodowlanej.
- Wyjmij wkładkę jednodołkową za pomocą sterylnej pęsety i umieść ją na środku naczynia pokrytego poli-L-ornityną/lamininą. Naciśnij wzdłuż krawędzi wkładki, aby przymocować ją do powierzchni naczynia.
- Ostrożnie odwróć naczynie do góry nogami, aby sprawdzić, czy wkładka jest mocno przylegająca.
- Trzymaj naczynie do góry nogami i zaznacz granicę komory wkładu za pomocą trwałego czarnego markera z bardzo cienką końcówką (Rysunek 1C).
6. Test migracji współkulturowej
- Zawiesić 3 x 104 interneurony GABA-ergiczne i 3 x 104 ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego w 70 μl pożywki do kohodowli (50% pożywki okołokomorowej bez GABA i 50% pożywki neuronalnej). Zasiej ten roztwór komórkowy w komorze na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią liczbę takich naczyń testowych.
nuta: GABA nie został dodany do pożywki kokulturowej, aby wykluczyć wpływ egzogennego GABA na migrację.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nie wyciekają z komory wkładki.
- Powoli dodawaj 1 ml pożywki do kokultury wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec wysychaniu powłoki.
nuta: Powoli dodawaj podłoże wzdłuż krawędzi naczynia, aby wkładka nie została zakłócona.
- Jako pierwszą kontrolę, wysiewaj 3 x 104 ludzkie interneurony GABA-ergiczne tylko w 70 μl pożywki do kokultury na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią ilość takich potraw.
- Jako druga kontrola, współwysiewanie 3 x 104 ludzkich interneuronów GABA-ergicznych z 3 x 104 kontroluje ludzkie komórki śródbłonka w 70 μl pożywki do kohodowli na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią ilość potraw.
- Inkubować szalki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo przyczepione i czy nie ma wycieku.
- Po 48 godzinach od wysiewu delikatnie wyjąć wkładkę za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że warstwa komórkowa nie jest naruszona (dzień 0).
- Usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki do współhodowli.
nuta: Odłóż na bok odpowiednią liczbę potraw do zdobycia obrazów dnia 0.
- Inkubować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
