Ustanowienie kohodowli interneuronów z komórkami śródbłonka okołokomorowego

Streszczenie

Źródło: Datta, D., et al. Migracja, chemo-przyciąganie i testy kohodowli dla ludzkich komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje technikę tworzenia wspólnej kultury interneuronów z komórkami śródbłonka okołonaczyniowego. Komórki dodaje się do jednodołkowej wkładki umieszczonej w naczyniu hodowlanym. Po tym, jak komórki przylgną do naczynia, wkładka jest usuwana, umożliwiając komórkom namnażanie się i interakcję oraz tworzenie kokultury.

Protokół

1. Hodowla i przechowywanie ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego

1. Utrzymuj ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej (patrz tabela materiałów) w pożywce z komórek śródbłonka okołokomorowego (podłoże E6 zawierające 50 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A [VEGF-A], 100 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 [FGF2] i kwasu gamma-aminomasłowego 5 μM [GABA]) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Zmieniaj medium co drugi dzień.
2. Rozmrozić matrycę błony podstawnej w temperaturze 4 °C i przygotować roztwór w stosunku 1:100, rozcieńczają....

Wyniki

Rycina 1: Przygotowanie wkładki hodowlanej. (A) Wkładka do hodowli z dwoma dołkami. (B) Wkładka jednodołkowa zamocowana w środku naczynia o średnicy 35 mm. (C) Zarys prostokątnej łaty zaobserwowany po wyjęciu wkładki.

....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór dysocjacji Accutazy	Millipore Sigma	Zobacz materiał SCR005	Roztwór do dysocjacji komórek (dla komórek śródbłonka okołokomorowego, krok 1.4)
Kontroluj ludzkie komórki śródbłonka	Dynamika komórkowa	Czynnik R1022
Kontroluj komórki śródbłonka Średni suplement	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1019
Fiolki kriogeniczne	Fisher Naukowy	03-337-7Y
DMEMF/12 średni	Thermofisher Naukowy	11320033
Dmso	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D2650
E6 średni	Thermofisher Naukowy	A1516401
FGF2	Thermofisher Naukowy	PHG0261
Fibronektyna	Thermofisher Naukowy	Nr kat. 33016-015
Pojemnik do zamrażania	Thermofisher Naukowy	5100
GABA (Księga GABA	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2129
Hemacytometr	Sigma-Aldrich	Z359629
Ludzkie neurony GABA-ergiczne	Dynamika komórkowa	Czynnik R1013
Pożywka podstawowa dla ludzkich neuronów GABA-ergicznych	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1010
Ludzki neuron GABA-ergiczny Suplement neuronowy	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1032
Laminina	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	Numer katalogowy: 356230	Matryca membrany podstawnej
Medium montażowe	Laboratoria wektorowe	H-1200
poli-L-ornityna	Sigma	Zobacz materiał p4957
Pbs	Thermofisher Naukowy	Numer katalogowy: 14190
Trypan niebieski	Thermofisher Naukowy	15250061
TrypLE	Thermofisher Naukowy	12563011	Roztwór dysocjacji komórek (dla interneuronów GABA-ergicznych i komórek śródbłonka, sekcje 3 i 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestaw	Technologie ogniw Lifeline	LL-0003	Składnik pożywki kontrolnej dla ludzkich komórek śródbłonka
2-dołkowa wkładka do hodowli silikonowej	ibidi	Numer katalogowy 80209
3-dołkowa wkładka do hodowli silikonowej	ibidi	Numer katalogowy: 80369
Czasza 35 mm	Corning	430165
Probówka stożkowa o pojemności 15 ml	Fisher Naukowy	07-200-886
4% roztwór PFA	Fisher Naukowy	AAJ19943K2
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-832-11

powiedział: powiedział: szt. powiedział: powiedział: szt.