$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Usunięcie serca i perfuzja Langendorffa
Owce o wadze 35-40 kg są znieczulane przy użyciu 4-6 mg/kg propofolu i 60-100 mg/kg pentobarbitalu sodu. Serca są usuwane za pomocą torakotomii i podłączane do systemu perfuzji Langendorffa z krążącym natlenionym (95% O2, 5% CO2) roztworem Tyrode'a o stałym natężeniu przepływu 240-270 ml/min, pH 7,4 i 35,5-37,5 °C. Skład Tyrode'a (w mM) to: NaCl 130, KCl 4,0, MgCl2 1, CaCl2 1,8, NaHCO3 24, NaH2PO4 1,2, Glukoza 5,6 i Albumina 0,04 g/L. Blebbistatyna 10 μM (Enzo Life Science International, INC. Plymouth Meeting, PA, USA) jest stosowana w celu zmniejszenia siły skurczu.
2. Migotanie przedsionków wywołane rozciąganiem w sercu owcy z perfuzją Langendorffa
Izolowane, perfundowane serce przechodzi nakłucie międzyprzegrodowe przedsionków, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia wewnątrzjamowego w obu przedsionkach. Wszystkie ujścia żył są następnie uszczelniane, z wyjątkiem żyły głównej dolnej, która jest kaniulowana i podłączona do czujnika cyfrowego (Biopac Systems transducer-TSD104A; Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, USA) oraz do kaniuli odpływowej, której otwarta wysokość nad przedsionkami kontroluje ciśnienie wewnątrzprzedsionkowe. Ciśnienie jest następnie zwiększane do 12 cm H2O, co prowadzi do ~30% wzrostu objętości przedsionków w stosunku do objętości przy 6 cm H2O. Ciśnienie jest utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Przed uszczelnieniem żył w każdej z żył płucnych umieszcza się cewniki z elektrodami tetrapolarnymi (Torq, Medtronic Inc./Minneapolis/MN/USA) w celu zarejestrowania sygnałów bipolarnych z dwóch elektrod dystalnych (częstotliwość próbkowania, 1,0 kHz) za pomocą wzmacniacza Biopac Systems (DA100C; Biopac Systems, Inc., Goleta, Kalifornia, Stany Zjednoczone). Dwie dodatkowe elektrody bipolarne wykonane z usztywnienia są umieszczone na dachu uszka lewego przedsionka (LAA) i górnej części uszka prawego przedsionka.
3. Konfiguracja mapowania optycznego
- Mapowanie nasierdziowe uszka lewego przedsionka. Wstrzyknięcie bolusa w ilości od 5 do 10 ml Di-4-ANEPPS (10 mg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i okres ładowania wynoszący 10 minut są potrzebne do uzyskania fluorescencji wrażliwej na napięcie po wzbudzeniu laserowym (532 nm) powierzchni nasierdzia. Emitowana fluorescencja jest następnie przesyłana przez filtr długoprzepustowy o długości fali 600 nm i rzutowana na kamerę wideo LittleJoe CCD (80x80 pikseli, SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, USA) i rejestrowana z szybkością 800 klatek na sekundę (patrz schemat na rysunku 1A). Pięciosekundowe filmy są uzyskiwane w odstępach 2-minutowych podczas AF. Powierzchnia odwzorowanej powierzchni nasierdzia wynosi ~14cm2.
- Optyczne mapowanie wsierdzia PLA nienaruszonego serca. Druga kamera CCD LittleJoe (80x80 pikseli) jest zsynchronizowana z kamerą nasierdziową. Dwukanałowy sztywny boroskop o średnicy 10 mm (Everest VIT, Inc. Flanders, NJ, USA) o 90-stopniowym polu widzenia jest wprowadzany przez przednią ścianę lewej komory, przez zastawkę mitralną i skoncentrowany na powierzchni wsierdzia PLA. Optycznie odwzorowany obszar na PLA wynosi ~4cm2, co pozwala na uwidocznienie czterech żył płucnych i pęczka międzyprzedsionkowo-płucnego (ryc. 1A, B). Boroskop jest montowany do kamery CCD za pomocą specjalnie wykonanego adaptera okularowego. Światło lasera o długości fali 532 nm jest następnie dostarczane do kanału wzbudzenia boroskopu przez ciekły światłowód (0,2 cala).
4. Protokół migotania przedsionków
W ciągłym rozciąganiu przedsionków AF jest indukowany przez stymulację impulsową (12 Hz, 5 ms impulsów, 2x próg rozkurczowy) przez elektrodę stymulacyjną umieszczoną na górze LAA. AF może być kontynuowany przez 50 minut, a 5-sekundowe filmy optyczne są rejestrowane w odstępach dwuminutowych. Nagrania dwubiegunowe zbierane są w sposób ciągły. Akwizycja filmów optycznych wyzwala jednoczesną akwizycję 5-sekundowych segmentów nagrań bipolarnych.
5. Analiza częstotliwości
Analiza częstotliwości pozwala na identyfikację obszarów o wysokim współczynniku aktywacji podczas AF, wraz z gradientami częstotliwości między lewym i prawym przedsionkiem. Mapy częstotliwości dominującej (DF) uzyskuje się z każdej filmu optycznego po zastosowaniu algorytmu szybkiej transformaty Fouriera (FFT) do sygnału fluorescencji szeregów czasowych zarejestrowanych w każdym pikselu. 7 FFT jest również stosowany do 5-sekundowych sygnałów bipolarnych (górnoprzepustowy filtrowany przy 3 Hz i dolnoprzepustowy filtrowany przy 35 Hz) zsynchronizowany z filmami optycznymi.
6. Dynamika migotania przedsionków
- Generowanie map fazowych. Analiza dynamiki migotania przedsionków wykorzystuje filmy fazowe generowane za pomocą transformacji Hilberta. 14 Krótko mówiąc, chwilowa faza potencjału czynnościowego zarejestrowanego w każdym pikselu jest określana przez przekształcenie pierwotnych sygnałów szeregów czasowych w taki sposób, że każda składowa widmowa jest przesunięta o odpowiadający jej ćwierćcykl. 15 Następnie chwilową fazę sygnału uzyskuje się z odwrotności tangensa stosunku sygnału przekształconego do sygnału pierwotnego. Kąt fazowy o wartościach od -π do π radianów jest reprezentowany jako ciągły schemat kolorów w celu skonstruowania mapy fazowej, w której ciągła przestrzenna zmiana fazy odzwierciedla proces wzbudzenia, repolaryzacji i odzyskiwania. 14
- Charakterystyka wzorców aktywacji. Za pomocą filmów fazowych (rysunek 2) można zidentyfikować różne klasy wzorców aktywacji, w tym:
- Wirnik identyfikuje się na podstawie obecności wszystkich faz zbiegających się w punkcie osobliwości trwającym więcej niż jeden obrót (rysunek 2A).
- Przełom definiuje się jako czoło fali pojawiające się w polu widzenia i rozchodzące się na zewnątrz (rysunek 2B) w kształcie tarczy.
- Czasoprzestrzennie zorganizowane fale okresowe definiuje się jako minimum cztery sekwencyjne fale okresowe pojawiające się z tego samego miejsca w polu widzenia, o podobnym kierunku i interwale między falami (rysunek 2C).
Dalsza kwantyfikacja pozwala na przestrzenną korelację domen o najwyższej częstotliwości z najczęstszym wzorcem aktywacji uzyskanym z tego konkretnego regionu. To ostatnie podkreśla kluczową rolę mapowania powierzchni wsierdzia PLA, ponieważ zwykle reprezentuje ona region, w którym znajdują się domeny o najwyższej częstotliwości podczas ostrego migotania przedsionków.
7. Reprezentatywne wyniki:
Gradienty częstotliwości dominującej (DF) od PLA do LAA i RAA występują podczas ostrego AF wywołanego rozciąganiem. Najwyższy obszar DF jest zlokalizowany albo w pobliżu jednej z żył płucnych, albo gdzieś w PLA. 11 Reprezentatywny epizod migotania przedsionków pokazano na rycinie 3, w którym najwyższy DF jest zlokalizowany na PLA (prawa dolna żyła płucna). Wyniki potwierdzają obecność źródeł wysokiej częstotliwości w PLA napędzających migotanie przedsionków zgodnie z gradientami DF od lewej do prawej obserwowanymi podczas zabiegów ablacyjnych w napadowym migotaniu przedsionków u ludzi. 16
Kwantyfikacja wzorców aktywacji za pomocą filmów z mapą faz pokazuje, że największa liczba wirników znajduje się na PLA i styku PLA i LAA. 8 Czasami możliwe jest zidentyfikowanie długotrwałych wirników, których środek obrotu (punkt osobliwości) lokalizuje się w domenie o najwyższej częstotliwości. 10 Ponieważ tkanka przedsionkowa stanowi strukturę trójwymiarową, identyfikacja wirników na zmapowanej powierzchni wsierdzia PLA sugeruje, że środek obrotu tych wirników (włókna) jest ostatecznie prostopadły do powierzchni obszaru mapowania. Rysunek 4 przedstawia taki wirnik zarejestrowany z wsierdzia PLA z jednoczesnym przewodzeniem migotania w kierunku LAA, co również koreluje z gradientem częstotliwości między PLA a LAA (odpowiednio 9 i 6,4 Hz). Liczba wirników jest konsekwentnie wyższa w PLA niż w LAA, co sugeruje istotną rolę ponownego wejścia w PLA w celu utrzymania arytmii w tym modelu.
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki potwierdzają teorię, że stabilne i szybkie wirniki w lewym przedsionku mogą napędzać ostre migotanie przedsionków wywołane rozciąganiem, a fale emanujące ulegają złożonym, przestrzennie rozmieszczonym wzorcom bloków przewodnictwa w kierunku prawego przedsionka, objawiając się jako migotanie przewodnictwa i stopniowo zmniejszając dominującą częstotliwość.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie konfiguracji eksperymentalnej. Odp .: Sztywny boroskop wprowadza się przez przednią ścianę lewej komory i ujście zastawki mitralnej i skupia się na powierzchni wsierdzia tylnego lewego przedsionka (PLA). Kamera CCD jest sprzężona z boroskopem, a oświetlenie laserowe jest zapewnione przez laserowy przewodnik cieczy połączony z dolną częścią boroskopu. Mapowanie nasierdzia wykonuje się na LAA. Elektrody bipolarne umieszcza się na prawym przedsionku i dachu lewego przedsionka. Dodatkowe sygnały dwubiegunowe uzyskuje się z żył płucnych. B: Widok z boku lewego atrium po otwarciu ściany bocznej w celach ilustracyjnych. Końcówka boroskopu oświetla powierzchnię wsierdzia PLA. Elektroda bipolarna znajduje się na dachu lewego przedsionka. LAA: uszek lewego przedsionka. LV: lewa komora. RA: prawe przedsionek. RV: prawa komora.

Rysunek 2.Różne wzorce aktywacji zidentyfikowane po wygenerowaniu filmów fazowych. A: Sekwencyjne zdjęcia uszka lewego przedsionka (LAA) pokazują obracanie się wirnika wokół jego środka obrotu (punkt osobliwości). Od lewej do prawej wykonywany jest jeden pełny obrót. B: Przykładowy przełomowy wzorzec aktywacji w LAA. Fala pojawia się w prawym górnym rogu pola widzenia i rozchodzi się na zewnątrz. C: Cztery czasoprzestrzennie zorganizowane fale okresowe (odpowiednio o długości 0, 182, 352 i 512 ms) nadchodzące z regionu ChALW w kierunku LAA. Izochrony są wykreślane w odstępach 10 ms. Dolny, kluczowy dla różnych faz potencjału czynnościowego jest oznaczony kolorami.

Rysunek 3. Identyfikacja regionów o największej częstości aktywności podczas ostrego migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem w izolowanym sercu owcy z perfuzją Langendorffa. A: Widok anatomiczny wyrostka lewego przedsionka (LAA), wyrostka prawego przedsionka (RAA) i tylnego lewego przedsionka (PLA). Obraz PLA to endoskopowy widok zmapowanego obszaru z czterema żyłami płucnymi (PV). B: Mapy DF uzyskane przez mapowanie optyczne na LAA i PLA. Wartość częstotliwości w RAA uzyskano z elektrogramów bipolarnych. Region o najwyższej częstotliwości znajduje się w ChALW. C: Reprezentatywne widma mocy, w których maksymalny DF odpowiada 12,4 Hz w obszarze PLA odpowiednich PV. LSPV: lewa górna żyła płucna. LIPV: lewa dolna żyła płucna. RSPV: prawa górna żyła płucna. RIPV: prawa dolna żyła płucna. Reprodukcja z odnośnika 11 (David Filgueiras Rama i José Jalife. Mechanizmy leżące u podstaw migotania przedsionków. w Basic Science for Clinical Electrophysiologist, Vol. 3 (ed. Charles Antzelevitch) 141-156 (SAUNDERS, 2011).

Rysunek 4. Mapy faz jednoczesnych (A, B) i mapy częstotliwości dominującej (C) z tylnego lewego przedsionka (PLA) i uszka lewego przedsionka (LAA). O: Sekwencyjne ujęcia z PLA pokazujące wirnik i dryfowanie jego punktu osobliwości. B: Jednoczesne ujęcia fazowe z LAA. Wzorce aktywacji pokazują fale propagacyjne kompatybilne z przewodnictwem migotanym. Punkty osobliwości są również obecne w korelacji z przerwami fal w obszarze przewodnictwa migotanego. (Zobacz także film 4) C: Równoczesne mapy częstotliwości dominującej z PLA i LAA. Najszybszy obszar znajduje się na ChALW (9 Hz), co koreluje z obecnością wirnika w analizie mapy fazowej. Najwyższa częstotliwość w LAA wynosi 6 Hz, co koreluje z przewodnictwem migotanym. Po prawej stronie panelu C pokazane są aktywacje optyczne pojedynczych pikseli z PLA i LAA.