1. Wycięcie serca i perfuzja w układzie Langendorffa
Owce o masie 35-40 Kg są znieczulane przy użyciu 4-6 mg/Kg propofolu oraz 60-100 mg/Kg pentobarbitalu sodowego. Serca są usuwane drogą torakotomii i podłączane do układu perfuzji Langendorffa z krążącym natlenionym (95% O2, 5% CO2) roztworem Tyrode'a przy stałym przepływie 240-270 ml/min, pH 7.4 i temperaturze 35.5-37.5 °C. Skład roztworu Tyrode'a (w mM) to: NaCl 130, KCl 4.0, MgCl2 1, CaCl2 1.8, NaHCO3 24, NaH2PO4 1.2, glukoza 5.6 oraz albumina 0.04 g/L. W celu zmniejszenia siły skurczu stosuje się blebbistatynę 10 μM (Enzo Life Science International, INC. Plymouth Meeting, PA, USA).
2. Migotanie przedsionków indukowane rozciąganiem w sercu owcy perfundowanym metodą Langendorffa
W wyizolowanym sercu z perfuzją wieńcową wykonuje się przezprzedziałkową punkcję przedsionka, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia wewnątrzjamowego w obu przedsionkach. Następnie wszystkie ujścia żył zostają zamknięte, z wyjątkiem żyły głównej dolnej, która zostaje kaniulowana i połączona z czujnikiem cyfrowym (przetwornik Biopac Systems-TSD104A; Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, USA) oraz z kaniulą odpływową, której wysokość otwartego końca nad przedsionkami kontroluje ciśnienie wewnątrzprzedsionkowe. Ciśnienie zwiększa się następnie do 12 cm H2O, co prowadzi do ~30% wzrostu objętości przedsionków w stosunku do objętości przy 6 cm H2O. Ciśnienie jest utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Przed zamknięciem żył w każdej z żył płucnych umieszcza się tetrapolarne cewniki z elektrodami (Torq, Medtronic Inc./Minneapolis/MN/USA), aby rejestrować sygnały bipolarne z dwóch dystalnych elektrod (częstotliwość próbkowania 1,0 kHz) przy użyciu wzmacniacza Biopac Systems (DA100C; Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, USA). Dwie dodatkowe, wykonane na zamówienie elektrody bipolarne umieszcza się na sklepieniu uszka lewego przedsionka (LAA) oraz na górnej części uszka prawego przedsionka.
3. Konfiguracja mapowania optycznego
- Mapowanie epikardialne uszka lewego przedsionka. W celu uzyskania fluorescencji napięciowo-zależnej po wzbudzeniu laserem (532 nm) powierzchni epikardium wymagane jest bolusowe wstrzyknięcie 5 do 10 ml Di-4-ANEPPS (10 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oraz 10 min okresu inkubacji. Emitowana fluorescencja jest następnie przepuszczana przez filtr długoprzepustowy 600 nm i rzutowana na kamerę wideo CCD LittleJoe (80x80 pikseli, SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, USA) oraz rejestrowana z częstotliwością 800 klatek na sekundę (patrz schemat na rysunku 1A). Pięciosekundowe nagrania są pozyskiwane w odstępach 2 min podczas AF. Powierzchnia mapowanego epikardium wynosi ~14 cm2.
- Endokardialne mapowanie optyczne PLA w nienaruszonym sercu. Druga kamera CCD LittleJoe (80x80 pikseli) jest zsynchronizowana z kamerą epikardialną. Dwukanałowy sztywny boreskop o średnicy 10 mm (Everest VIT, Inc. Flanders, NJ, USA) z 90-stopniowym polem widzenia jest wprowadzany przez przednią ścianę lewej komory, przez zastawkę mitralną i ogniskowany na powierzchni endokardialnej PLA. Optycznie mapowany obszar na PLA wynosi ~4 cm2, co pozwala na wizualizację czterech żył płucnych i przedsionkowego pęczka przegrodowo-płucnego (rysunek 1A, B). Boreskop jest przymocowany do kamery CCD za pomocą niestandardowego adaptera okularowego. Światło lasera 532 nm jest następnie dostarczane do kanału wzbudzenia boreskopu za pomocą ciekłego światłowodu (rdzeń 0.2 in).
4. Protokół migotania przedsionków
W warunkach ciągłego rozciągania przedsionka AF jest indukowane poprzez stymulację seryjną (12 Hz, impulsy 5 ms, 2x próg rozkurczowy) za pomocą elektrody stymulującej umieszczonej na szczycie LAA. AF trwa przez 50 minut, a 5-sekundowe filmy optyczne są rejestrowane w odstępach dwuminutowych. Rejestracja bipolarna odbywa się w sposób ciągły. Pozyskiwanie filmów optycznych wyzwala jednoczesną akwizycję 5-sekundowych fragmentów zapisów bipolarnych.
5. Analiza częstotliwości
Analiza częstotliwości umożliwia identyfikację obszarów o wysokim stopniu aktywacji podczas AF, a także gradientów częstotliwości między lewym a prawym przedsionkiem. Mapy częstotliwości dominującej (DF) są uzyskiwane z każdego filmu optycznego po zastosowaniu algorytmu szybkiej transformaty Fouriera (FFT) do szeregów czasowych sygnału fluorescencji rejestrowanego w każdym pikselu.7 FFT jest również stosowane do 5-sekundowych sygnałów bipolarnych (przepuszczonych przez filtr górnoprzepustowy 3 Hz i filtr dolnoprzepustowy 35 Hz) zsynchronizowanych z filmami optycznymi.
6. Dynamika migotania przedsionków
- Generowanie map fazowych. Analiza dynamiki AF wykorzystuje filmy fazowe generowane za pomocą transformacji Hilberta.14 W skrócie, chwilowa faza potencjału czynnościowego zarejestrowanego w każdym pikselu jest wyznaczana poprzez transformację oryginalnych sygnałów szeregów czasowych w taki sposób, aby każda składowa widmowa została przesunięta o odpowiadający jej ćwierć cyklu.15 Następnie chwilową fazę sygnału uzyskuje się z tangensa odwrotnego stosunku sygnału przetransformowanego do sygnału oryginalnego. Kąt fazowy, o wartościach od -π do π radianów, jest reprezentowany za pomocą ciągłego schematu kolorystycznego w celu konstrukcji mapy fazowej, w której ciągła zmiana fazy przestrzennej odzwierciedla proces pobudzenia, repolaryzacji i regeneracji.14
- Charakterystyka wzorców aktywacji. Za pomocą filmów fazowych można zidentyfikować różne klasy wzorców aktywacji (Ryc. 2), w tym następujące:
- Rotor jest identyfikowany przez obecność wszystkich faz zbiegających się w punkcie osobliwości, trwającą dłużej niż jeden obrót (Ryc. 2A).
- Przełamanie (breakthrough) definiuje się jako front fali pojawiający się w polu widzenia i rozprzestrzeniający się na zewnątrz (Ryc. 2B) w formie wzoru przypominającego tarczę.
- Spatio-temporalnie zorganizowane fale periodyczne definiuje się jako minimum cztery następujące po sobie fale periodyczne wyłaniające się z tego samego miejsca w polu widzenia, o podobnym kierunku i odstępie międzyfalowym (Ryc. 2C).
Dalsza kwantyfikacja umożliwia korelację przestrzenną domen o najwyższej częstotliwości z najczęstszym wzorcem aktywacji uzyskanym z tego konkretnego obszaru. To drugie podkreśla kluczową rolę mapowania powierzchni wsierdzia PLA, ponieważ obszar ten zazwyczaj stanowi miejsce, w którym podczas ostrego AF znajdują się domeny o najwyższej częstotliwości.
7. Reprezentatywne wyniki:
Gradienty częstotliwości dominującej (DF) od PLA do LAA i RAA występują podczas ostrego migotania przedsionków (AF) wywołanego rozciąganiem. Obszar o najwyższym DF zlokalizowany jest w jednej z żył płucnych, w jej pobliżu lub gdziekolwiek w PLA.11 Reprezentatywny epizod AF przedstawiono na Rysunku 3, w którym najwyższy DF zlokalizowany jest w PLA (prawa dolna żyła płucna). Wyniki te potwierdzają obecność wysokoczęstotliwościowych źródeł w PLA napędzających AF, co jest zgodne z gradientami DF w kierunku z lewej do prawej, obserwowanymi podczas procedur ablacyjnych w napadowym AF u ludzi.16
Ilościowa analiza wzorców aktywacji z wykorzystaniem filmów z mapowania fazowego wykazuje, że największa liczba rotorów występuje w obrębie PLA oraz na połączeniu między PLA a LAA.8 Okazjonalnie możliwe jest zidentyfikowanie długotrwałych rotorów, których centrum rotacji (punkt osobliwości) pokrywa się z domeną o najwyższej częstotliwości.10 Ponieważ tkanka przedsionkowa stanowi strukturę trójwymiarową, identyfikacja rotorów na zmapowanej powierzchni wsierdzia PLA sugeruje, że oś obrotu tych rotorów (filament) jest ostatecznie prostopadła do powierzchni obszaru mapowania. Rysunek 4 przedstawia taki rotor zarejestrowany z wsierdzia PLA przy jednoczesnym przewodzeniu migotliwym w kierunku LAA, co koreluje również z gradientem częstotliwości między PLA a LAA (odpowiednio 9 i 6,4 Hz). Liczba rotorów jest konsekwentnie wyższa w PLA niż w LAA, co sugeruje istotną rolę reentry w obszarze PLA w utrzymywaniu arytmii w tym modelu.
Ogólnie wyniki te wspierają teorię, że stabilne i szybkie rotory w lewym przedsionku mogą wywoływać ostry migotanie przedsionków (AF) indukowane rozciąganiem, a emitowane fale ulegają złożonym, przestrzennie rozłożonym wzorcom blokady przewodzenia w kierunku prawego przedsionka, co objawia się przewodzeniem migotliwym i stopniowym spadkiem częstotliwości dominującej.

Rycina 1. Schematyczny przedstawienie układu eksperymentalnego. A: Sztywny endoskop (borescope) jest wprowadzany przez przednią ścianę lewej komory i otwór zastawki mitralnej, a następnie ogniskowany na powierzchni wszczepowej tylnej części lewego przedsionka (PLA). Do endoskopu podłączona jest kamera CCD, a oświetlenie laserowe jest dostarczane przez ciekły światłowód laserowy połączony z dolną częścią endoskopu. Mapowanie epikardialne jest wykonywane na LAA. Elektrody bipolarne są umieszczone w prawym przedsionku i na sklepieniu lewego przedsionka. Dodatkowe sygnały bipolarne są pobierane z żył płucnych. B: Widok boczny lewego przedsionka po otwarciu ściany bocznej w celach ilustracyjnych. Końcówka endoskopu oświetla powierzchnię wszczepową PLA. Elektroda bipolarna znajduje się na sklepieniu lewego przedsionka. LAA: uszek lewego przedsionka. LV: lewa komora. RA: prawy przedsionek. RV: prawa komora.

Rycina 2.Różne wzorce aktywacji zidentyfikowane po wygenerowaniu filmów fazowych. A: Sekwencyjne migawki z uszka lewego przedsionka (LAA) pokazują obrót rotora wokół jego centrum rotacji (punktu osobliwości). Od lewej do prawej wykonano jeden pełny obrót. B: Przykładowy wzorzec aktywacji przełamaniowej w LAA. Fala pojawia się w prawym górnym rogu pola widzenia i rozprzestrzenia się na zewnątrz. C: Cztery czasowo-przestrzennie zorganizowane fale okresowe (odpowiednio w 0, 182, 352 i 512 ms) nadchodzące z obszaru PLA w kierunku LAA. Izochrony naniesiono w odstępach 10 ms. Na dole znajduje się legenda dla różnych faz potencjału czynnościowego, oznaczona kolorami.

Rycina 3. Identyfikacja obszarów o najwyższej częstotliwości aktywności podczas ostrego migotania przedsionków (AF) indukowanego rozciąganiem w izolowanym sercu owczym perfundowanym w układzie Langendorffa. A: Widok anatomiczny uszka lewego przedsionka (LAA), uszka prawego przedsionka (RAA) oraz tylnej części lewego przedsionka (PLA). Obraz PLA przedstawia widok endoskopowy zmapowanego obszaru z czterema żyłami płucnymi (PVs). B: Mapy DF uzyskane za pomocą mapowania optycznego w LAA i PLA. Wartość częstotliwości w RAA uzyskano z elektrogramów bipolarnych. Obszar o najwyższej częstotliwości znajduje się w PLA. C: Reprezentatywne widma mocy, w których maksymalne DF odpowiada wartości 12.4 Hz w obszarze PLA prawych żył płucnych. LSPV: lewa górna żyła płucna. LIPV: lewa dolna żyła płucna. RSPV: prawa górna żyła płucna. RIPV: prawa dolna żyła płucna. Reprodukowano z referencji 11 (David Filgueiras Rama & José Jalife. Mechanisms Underlying Atrial Fibrillation. w Basic Science for Clinical Electrophysiologist, Vol. 3 (red. Charles Antzelevitch) 141-156 (SAUNDERS, 2011).

Rycina 4. Symultaniczne mapy fazowe (A, B) oraz mapy częstotliwości dominującej (C) z tylnej ściany lewego przedsionka (PLA) oraz uszka lewego przedsionka (LAA). A: Sekwencyjne migawki z PLA pokazujące rotor oraz dryf punktu osobliwości. B: Symultaniczne migawki fazowe z LAA. Wzorce aktywacji wykazują fale propagacji zgodne z przewodnictwem migotliwym. Punkty osobliwości są również obecne w korelacji z przerwaniami fal w obszarze przewodnictwa migotliwego. (Patrz również wideo 4) C: Symultaniczne mapy częstotliwości dominującej z PLA i LAA. Najszybszy obszar znajduje się w PLA (9 Hz), co koreluje z obecnością rotora w analizie mapy fazowej. Najwyższa częstotliwość w LAA wynosi 6 Hz, co koreluje z przewodnictwem migotliwym. Po prawej stronie panelu C przedstawiono optyczne aktywacje pojedynczych pikseli z PLA i LAA.