$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie MEA
Uwaga: MEA składają się ze szklanego podłoża, mikro-prefabrykowanych metalowych elektrod i warstwy izolacyjnej z polimeru SU-8. Na potrzeby tego badania zamówiono dostępne na rynku MEA z niestandardowym układem matrycy elektrod (ryc. 1 A&B). 68 elektrod jest ułożonych w prostokątną siatkę, która jest podzielona na dwie strefy za pomocą rowka o szerokości 300 μm, wolnego od elektrod, przewodów elektrycznych i izolacji. Każda elektroda ma wymiary 40 x 40 μm i są one oddalone od siebie o 200 μm od środka do środka. Cztery duże elektrody uziemiające są umieszczone wokół miejsca rejestracji. Różnią się one od innych dostępnych na rynku standardowych MEA rozmiarem (21 mm x 21 mm) i nie posiadają stałej komory zapisu.
- W celu dezynfekcji płukać MEA w 100% etanolu (2x), 70% etanolu (1x) i wodzie destylowanej (2x) przez co najmniej 30 sekund każdy. Pozostaw do wyschnięcia. Umieść 10 - 12 MEA na czystej szklanej szalce Petriego (150 mm x 25 mm) i zamknij pokrywkę.
- Autoklaw MEA przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Przechowywać w temperaturze RT.
- Przygotować roztwór powlekający (patrz wykaz materiałów) dla MEA i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
- Umieść każdy MEA na indywidualnej sterylnej szalce Petriego (35 mm x 10 mm).
- Za pomocą schłodzonej pipety nałożyć 150 μl schłodzonego roztworu powlekającego na elektrody i zamknąć pokrywę szalki Petriego. Po około 10 minutach sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby delikatnie usuń je gumową szpatułką. Odstaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
- Odessać pozostałości roztworu powlekającego, przemyć 1x pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych oraz 2x destylowaną, sterylną wodą. Jeśli MEA nie zostaną wykorzystane do następnego dnia, należy je przechowywać przez noc w destylowanej, sterylnej wodzie o temperaturze 37 °C w inkubatorze (O/N). W przeciwnym razie pozostaw do wyschnięcia bezpośrednio w temperaturze pokojowej.
2. Składniki niezbędne do przygotowania i wzrostu kultur organotypowych
- Przygotować bezwapniowy roztwór myjący (patrz lista materiałów).
- Rozpuść osocze kurczaka w roztworze do przemywania (1:1, delikatnie wstrząsnąć, unikać tworzenia się pęcherzyków), odwirować przy 3 000 x g przez około 20 minut i zdekantować klarowną zawartość do sterylnej probówki. Podać 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Rozpuść odpowiednio trombinę z osocza bydlęcego (200 j./ml) i sterylnego filtra (filtr porowy 0,2 μm). Podwielokrotność 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Na 30 kultur przygotuj 100 ml pożywki (patrz lista materiałów).
3. Wycięcie tkanki rdzenia kręgowego
Uwaga: Procedura daje, w zależności od liczby zarodków, plastry rdzenia kręgowego dla około 25 - 35 kokultur i jest przygotowywana w kapturze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
- Nałożyć śmiertelną dawkę pentobarbitalu (0,4 ml) na matkę zwierzęcia we wstrzyknięciu domięśniowym. Potwierdź głębokie znieczulenie, sprawdzając odruch wycofania pedału. Dostarczyć zarodki szczurów w 14 dniu (E14) przez cesarskie cięcie i złożyć w ofierze przez ścięcie.
- Przenieś ciała zarodków na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.
- Wykonaj jedno pełne cięcie poprzeczne skalpelem nad kończynami tylnymi, a drugie nad kończynami przednimi i usuń kończyny z ciała. Następnie wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby oddzielić wnętrzności od tylnej części zawierającej rdzeń kręgowy.
- W celu pokrojenia należy przenieść tylne części zawierające rdzeń kręgowy pojedynczo na dysk montażowy i przyciąć na grubość 225 - 250 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek. Nałóż kroplę roztworu myjącego na posiekaną tkankę i przenieś plastry szpatułką na szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm wypełnione sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.
- Dla każdego plastra osobno wypreparuj rdzeń kręgowy z pozostałej tkanki. Pozostaw przyczepione zwoje korzenia grzbietowego.
- Odstaw plastry na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. Montaż wycinków tkanki rdzenia kręgowego na MEA
- Podgrzać sterylną pożywkę w inkubatorze (37 °C, lekko odkręcona pokrywka do natlenienia).
- Umieść MEA za pomocą sterylnej pęsety z gumowymi końcówkami w punkcie RT na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z ustawioną ostrością na matrycy elektrod. Wyśrodkuj kroplę 6 μl osocza kurzego na czystym, wolnym od kurzu i sterylnym układzie elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego z brzusznymi bokami skierowanymi do siebie do kropli osocza. Nie dotykaj elektrod szpatułką.
- Dodać 8 μl trombiny wokół kropelki osocza kurczaka. Używając końcówki pipety trombinowej, ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę osocza kurczaka/trombiny wokół dwóch plasterków. Również w tym przypadku nie należy dotykać bezpośrednio kruchego układu elektrod. Tuż przed krzepnięciem odessać nadmiar osocza kurczaka/trombiny.
- Zakryj szalkę Petriego, aby utrzymać wysoką wilgotność, podczas gdy zespół MEA/kultura siedzi przez około 1 godzinę w wilgotnej komorze wewnątrz inkubatora w temperaturze 37 °C.
- Ostrożnie dodać 10 μl pożywki do komory hodowlanej, zakryć szalkę Petriego i włożyć z powrotem do inkubatora na około 30 minut.
- Umieść każdy zestaw MEA/hodowli ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami w rurce rolkowej, dodaj 3 ml pożywki i szczelnie zamknij pokrywkę. Umieścić rurkę rolkową w bębnie rolkowym obracającym się z prędkością 1-2 obr./min w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Zmienić połowę pożywki po 7 dniach in vitro (DIV), a następnie 1-2 razy w tygodniu.
5. Uszkodzenia mechaniczne
- Wyjmij zestaw MEA/kultura ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami z rurki rolkowej i umieść na szalce Petriego bez pożywki pod mikroskopem stereoskopowym z tkanką w ostrości. Sprawdź wzrokowo, czy dwa plasterki są połączone.
- Trzymaj zespół MEA/kultura stabilnie, umieszczając pęsetę z gumowymi końcówkami na MEA.
- Umieść ostrze skalpela w rowku MEA w pobliżu plastrów tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo.
- Podnieś rękojeść skalpela do góry, ale pozwól ostrzu skalpela pozostać w rowku MEA w taki sposób, aby ostrze "toczyło się" od podstawy do czubka, a tym samym przecinało tkankę pokrywającą rowek.
- W razie potrzeby należy utwardzić wszelkie resztki połączeń tkankowych za pomocą końcówki igły 25 G. Pracuj tylko w obszarze w rowku i nie dotykaj delikatnych krawędzi.
- Włóż zestaw MEA/kulturę z powrotem do rury rolkowej. Dostarczyć 3 ml świeżej pożywki do kultur i umieścić je z powrotem w bębnie rolkowym w inkubatorze.
6. Elektrofizjologiczne zapisy spontanicznej aktywności
- Aby zbadać funkcjonalną regenerację między dwoma wycinkami rdzenia kręgowego po wybranej liczbie DIV, zamontuj zespół MEA/hodowla w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i nałóż około 500 μl roztworu zewnątrzkomórkowego (patrz lista materiałów).
- Odczekaj 10 minut przed pierwszym nagraniem, aby system się ustabilizował.
- Rejestruj podstawową spontaniczną aktywność 2x przez około 10 minut z każdej elektrody wykrywającej aktywność MEA w RT.
- Aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe, wymieniaj się roztworem zewnątrzkomórkowym po każdej sesji nagraniowej.
