Wytwarzanie dojrzałych organoidów móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu bioreaktorów jednorazowego użytku

Streszczenie

Źródło: Silva, T.P., et al. Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka przez barwienie immunologiczne. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje technikę generowania dojrzałych organoidów móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą jednorazowego bioreaktora 3D. Bioreaktor ułatwia tworzenie agregatów iPSC, które następnie poddawane są działaniu szeregu pożywek hodowlanych wzbogaconych w czynniki wzrostu i chemokiny, które indukują różnicowanie agregatów iPSC w dojrzałe organoidy móżdżku. Następnie organoidy są zbierane i kriokonserwowane do dalszej analizy.

Protokół

1. Umieszczanie ludzkich iPSC w bioreaktorze

1. Inkubować iPSC wyhodowane jako monowarstwy w mTeSR1 uzupełnione 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 (ROCKi). Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki do każdej studzienki z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO₂,
   nuta: ROCKi służy do ochrony zdysocjowanych iPSC przed apoptozą.
2. Po 1 godzinie inkubacji odessać zużyte podłoże z każdej studzienki i przemyć 1x 1 ml 1× PBS na studzienkę.
3. Dodać 1 ml pożywki do oddzielania komórek (patrz tabela materiałów) do każdego dołka na....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw BrainPhys Neuronal Medium N2-A i SM1	5793 - 500 ml	Technologie komórek macierzystych
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy	11905031	Rybak termiczny
BSA oczyszczony przez krystalizację	Numer katalogowy: 5470	Sigma
Zobacz materiał DMEM-F12	Nr kat. 32500-035	Rybak termiczny
Surowica bydlęca płodu	A3840001	Rybak termiczny
Żelatyna ze skóry bydlęcej	Zobacz materiał G9391	Sigma
Glutamax I	Numer katalogowy: 10566-016	Rybak termiczny
Dibutyryl cAMP	SC- 201567B -500mg	Frilabo (Jezioro Jezioro)
Szynka F12	21765029	Rybak termiczny
Ludzka episomalna linia iPSC	A18945	Rybak termiczny	Protokół iPSC6.2
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	12440046	Rybak termiczny
insulina	Zobacz materiał 91077C	Sigma
iPS DF6-9-9T.B		WiCell (komórka WiCell)
Izopentan	PHR1661-2ML	Sigma
Kwas L-askorbinowy	A-92902	Sigma
Matrigel	Numer telefonu 354230	Corning	matryca membrany podstawnej
Monotioglicerol	Zobacz materiał M6154	Sigma
mTeSR1	85850 -500ml	Technologie komórek macierzystych
Suplement N2	17502048	Rybak termiczny
Neuropodstawowy	12348017	Rybak termiczny
Paraformaldehyd	158127	Sigma
PBS-0.1 Naczynie jednorazowego	Kod produktu: IA-0.1-D-001	PBS Biotechnologia
Jednostka bazowa PBS-MINI MagDrive	Kod produktu: IA-UNI-B-501	PBS Biotechnologia
Rekombinowany ludzki BDNF	Rozdział 450-02	Peprotech
Rekombinowany ludzki bFGF/FGF2	100-18 mld	Peprotech
Rekombinowany ludzki FGF19	100-32 Rozdział 100-32	Peprotech
Rekombinowany ludzki GDNF	450-10	Peprotech
Rekombinowany ludzki SDF1	300-28A	Peprotech
Inhibitor ROCK	Y-27632 72302	Technologie komórek macierzystych
SB431542	Zobacz materiał S4317	Sigma
sacharoza	Zobacz materiał S7903	Sigma
Związek Tissue-Tek OCT	25608-930	Firma VWR

T powiedział: użytku szt.