Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Streszczenie

Źródło: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak. J. Vis. Exp. (2015)

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

Przygotuj roztwór mieszania pożywek do wirowania gęstości, umieszczając 90 ml 10x PBS w 264 ml ultraczystej wody dejonizowanej (3.93x) w sterylnym plastikowym pojemniku. Miareczkować do pH 7,0-7,2 za pomocą HCl i sterylizować przez filtr 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Przygotuj pożywkę wirową o gęstości 70%, łącząc 18 ml roztworu mieszanki pożywki do wirowania o gęstości z 30 ml pożywki wirowej o gęstości (szczegóły na liście materiałów) w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem doprowadzić do temperatury regulowanej.

Przygotuj pożywkę wirową o gęstości 37%, łącząc 9,6 ml DPBS z 10,4 ml pożywki wirowej o gęstości 70% w probówce wirówkowej o gęstości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem doprowadzić do temperatury regulowanej.

1. Izolacja PBMC naciekających glejaka

1. Używając czystej, jednosiecznej żyletki, wyizoluj obszar mózgu zawierający guz, wykonując strzałkowe cięcie w środku mózgu, aby przeciąć dwie półkule. Odwróć półkulę ipsilateralną przyśrodkową w dół i wykonaj dwa nacięcia koronalne na poziomie móżdżku i opuszki węchowej, aby wyizolować tkankę docelową zawierającą implant nowotworowy (ryc. 1A). Równoważna część półkuli przeciwległej może być również odizolowana i wykorzystana jako kontrola ujemna.
2. Umieść tkankę docelową w odpowiednio oznakowanym szklanym młynku do tkanek Dounce zawierającym 1 ml DPBS, wciśnij tłok do końca w dół i przekręć 7 razy, aby początkowo rozbić tkankę. Podnieś tłok, aby płyn opadł z powrotem na dno młynka do chusteczek. Powtórz ten krok trzy razy; Należy jednak przekręcić tłok tylko 4 razy w ciągu następnych dwóch powtórzeń i 3 razy podczas ostatniego powtórzenia, aby uniknąć nadmiernego rozdarcia tkanki.
3. Za pomocą mikropipety P-1000 nałóż kolejno trzy objętości lodowatego DPBS o objętości 1 ml wzdłuż boków tłoka, aby spłukać je do młynka do tkanek.
4. Ponownie zawiesić rozdrobnioną materię mózgową, pipetując w górę iw dół i umieszczając ją w oznakowanej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie. Opłucz boki młynka do tkanek Dounce dodatkowym 1 ml lodowatego DPBS i dodaj do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Trzymaj wszystkie probówki zawierające rozdrobnioną materię mózgową na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone.
5. Po przetworzeniu wszystkich próbek, odwirować rozdrobnioną materię mózgową w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pistoletu do pipetowania i ponownie zawiesić granulowaną materię mózgową w 1 ml uprzednio przygotowanych enzymów trawiennych kolagenazy/DNazy-I za pomocą P-1000. Umieścić probówki wirówkowe o pojemności 15 ml w stojaku na probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
7. Delikatnie mieszać próbki dwukrotnie w okresie inkubacji, przesuwając probówki, aby ułatwić dezagregację tkanek.
8. Dodać 6 ml lodowatego DPBS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do każdej probówki, aby rozcieńczyć enzymy trawienne. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić, i przefiltrować całkowitą objętość przez sterylne filtry siatkowe nylonowe 70 μm do nowych, oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml na lodzie.
9. Obracać zawiesinę komórek mózgowych w dół przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać jednokomórkową osadkę (ryc. 1B). Po wyjęciu probówek o pojemności 15 ml z wirówki, umieścić je na lodzie i zwiększyć temperaturę wirówki do około 21 °C, przygotowując się do następnego etapu.
10. Całkowicie usunąć supernatant z każdej probówki zawierającej komórki mózgowe i wstępnie ponownie zawiesić granulki w 1 ml pożywki wirówkowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P-1000. Następnie dodać 4 dodatkowe mililitry pożywki wirówkowej o gęstości 70% do każdej probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Mocno przykręć nakrętki i homogenizuj zawiesinę komórek, kilkakrotnie delikatnie odwracając do probówek.
11. Wyjmij z lodu probówki wirówkowe o pojemności 15 ml zawierające komórki mózgowe zawieszone w pożywce wirówkowej o gęstości 70% i umieść w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej. Pojedynczo ostrożnie nakładaj 2 ml roztworu pożywki wirówkowej o gęstości 37% na 5 ml pożywki wirowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P-1000, aby utworzyć czystą powierzchnię styku między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o gęstości (ryc. 1C).
    1. Użyj markera z cienką końcówką, aby wskazać położenie interfejsu, aby można go było łatwo zidentyfikować po odwirowaniu, gdy rozróżnienie staje się mniej widoczne.
12. Odkręcaj probówki wirówkowe o pojemności 15 ml przy 740 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy, aby uniknąć zakłócenia interfejsu.
13. Po odwirowaniu zebrać PBMC, które nagromadziły się na granicy faz między dwiema warstwami pożywki do wirowania o dużej gęstości (rysunek 1D), wprowadzając mikropipetę P-200 do probówki wzdłuż jej boku, ostrożnie omijając warstwę lipidową.
    1. Po znalezieniu się na poziomie pasma PBMC powoli wyekstrahuj 200 μl z powierzchni warstwy pożywki wirówkowej o gęstości 70% i umieść ją w odpowiednio oznakowanej probówce FACS z polipropylenu na lodzie. Powtórzyć tę czynność raz dla całkowitej objętości 400 μl na próbkę.
14. Dodać 3 ml buforu przepływowego do każdej probówki FACS zawierającej 400 μl PBMC w celu wystarczającego rozcieńczenia pożywki wirowej o dużej gęstości, a następnie odwirować komórki w temperaturze 660 x g (maks. RCF) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Wyniki

Rycina 1: Izolacja PBMC naciekających glejaka. (A) Strategia preparacji tkanki mózgowej myszy zawierającej implanty glejaka ortotopowego we wczesnym stadium. Górny panel przedstawia strzałkową bisekcję półkuli ipsilateralnej z dala od półkuli przeciwległej. Dolny panel pokazuje dwa dodatkowe nacięcia koronalne niezbędne do wyizolowania tkanki docelowej zawierającej implant nowotworo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikacja Dulbecco Orła Medium	Gibco (firma Gibco)	12430-054	Zawiera 4,5 g/l D-glukozy, L-glutaminę, 25 mM HEPES i czerwień fenolową
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144	Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
Surowica bydlęca płodu	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicylina Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	10 000 j./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny
0,6 ml stożkowe mikroprobówki polipropylenowe	Genesee Scientific	22-272
Poliuretanowe wiadro na lód	Marka rybacka	Numer katalogowy: 02-591-45	Pojemność: 0.152 uncji (4.5L)
Kolagenaza (typ I-S)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C1639	Z Clostridium histolyticum
Deoksyrybonukleaza I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2 000 jednostek Kunitz na mg suchej masy
Duże nożyczki preparacyjne	Ted Pella Inc.	1316
Małe nożyczki preparacyjne	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 14094-11
Kleszcze z końcem	Ted Pella Inc.	Numer katalogowy: 13250
Szklany młynek do tkanek o pojemności 7 ml	Kontes	KT885300-0007
Media do wirowania o gęstości Percoll	GE Opieka zdrowotna	Galaktyka GE17-0891-01
Pipety serologiczne 10 ml	Genesee Scientific	12-104	Jednorazowego użytku; sterylne
70μm sterylne sitka do komórek z siatki nylonowej	Marka rybacka	22363548
15 ml polipropylenowe probówki wirówkowe	Genesee Scientific	21-103	Stożkowe dno
50 ml polipropylenowe probówki wirówkowe	Genesee Scientific	21-108	Stożkowe dno
Rurki polipropylenowe FACS 12x75mm z okrągłym dnem	Marka rybacka	14-956-1B

TGLI SZT. Rozdział