$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
- Przygotuj dwa laboratoryjne nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej i dwa kleszcze laboratoryjne ze stali nierdzewnej. Umieść wszystkie narzędzia w autoklawie i umieść w okapie hodowlanym O/N pod światłem ultrafioletowym (UV) w celu sterylizacji.
- Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej o minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) (10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 6 μg/ml ampicyliny) i przeprowadzić sterylizację filtracyjną. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.
- Przygotować 24-dołkowe płytki hodowlane zawierające szkiełka nakrywkowe o grubości 14 mm i grubości 1. Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie i pokryć poli-d-lizyną (PDL) w stężeniu 100 mg/l. Światło UV sterylizuje O / N.
2. Przygotowanie roztworów do hodowli komórek ziarnistych móżdżku (CGC)
- Przygotować "roztwór A" (100 ml) w autoklawowanym, poddanym działaniu światła UV, sterylnymdH2O, poddanym działaniu promieniowania UV, zawierający 250 mg glukozy, 300 mg albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 955 mg soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] (wolna od Ca2+ i Mg+) i 1 ml 3,8% MgSO4·7H2O.
- Przygotować "roztwór B" (10 ml) zawierający 1 ml 5 mg/ml trypsyny rozcieńczonej w 9 ml roztworu A.
- Przygotować "roztwór C" (10 ml) zawierający 1000 jednostek DNazy, 0,5 mg inhibitora trypsyny sojowej, 100 μl 3,8% MgSO4·7H2O, rozcieńczony do 10 ml roztworem A.
- Przygotować roztwór D (20 ml) zawierający 3,2 ml roztworu C, rozcieńczony do 20 ml roztworem A.
- Przygotować roztwór BSA/Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) zawierający EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4·7H2O i 4% BSA, pH 7,4.
- Przygotować ester metylowy L-leucyny (LME), dodając czystą LME do 5 ml pożywki hodowlanej MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME, przywrócić roztwór do pH 7,4 za pomocą pH-metru laboratoryjnego i wysterylizować filtrem za pomocą filtra strzykawkowego z polieterosulfonu (PES) o średnicy 0,2 μm.
3. Hodowla CGC
- Zbierz móżdżek od 4-7 dniowych szczeniąt szczurów. Umieścić natychmiast na szalce Petriego zawierającej 5 ml roztworu A na lodzie.
- Odlej nadmiar roztworu z móżdżku i umieść tkankę w pokrywie szalki Petriego.
- Drobno posiekaj tkankę dobrze podpaloną żyletką w co najmniej trzech różnych kierunkach.
- Dodać rozdrobnioną chusteczkę do roztworu B (przepłukać szalkę Petriego roztworem, aby upewnić się, że utracono ograniczoną ilość tkanki) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut. Wstrząsać delikatnie co kilka minut.
- Dodać roztwór D (20 ml) do probówki, aby zneutralizować trypsynę, wstrząsnąć i odwirować przy 65 x g przez 5 minut.
- Odlewać supernatant.
- Zawiesić ponownie w 4 ml roztworu C. Dobrze rozprowadzić (około 10 razy każda) trzema pipetami ze szkła płomienistego o zmniejszającej się średnicy, aż zawiesina stanie się możliwie najbardziej jednorodna.
- Powoli i delikatnie dodaj kilka kropli tego homogenatu na wierzch BSA/EBSS. Jeśli zacznie zapadać się przez BSA/EBSS, rozcieraj więcej i/lub dodaj trochę więcej roztworu C. Homogenat powinien znajdować się w warstwie na wierzchu BSA/EBSS. Nie potrząsać. Wirować z prędkością 100 x g przez 5 min.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad (miękki) w 1 ml pożywki MEM.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki na 800 000 komórek/szkiełko nakrywkowe w 500 μl pożywki MEM. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 6% CO2 .
- Zmień podłoże następnego dnia (24-36 godzin po przygotowaniu). Przygotować roztwór pożywki MEM zawierający 10 μM inhibitora cyklu komórkowego arabinofuranozylocytydyny (AraC).
- Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy zachować 250 μl starej pożywki na świeżej płytce 24-dołkowej, odessać resztę, dodać 250 μl normalnej pożywki MEM i odessać ją w celu przepłukania komórek. Następnie dodaj 250 μl starej pożywki z powrotem do komórek i uzupełnij 250 μl pożywki zawierającej AraC.
nuta: Komórki mogą być używane od 6 dni in vitro (DIV).
>4. Selektywne zubożanie mikrogleju (wykonywane przy 6 DIV)
- Dodać czystą LME do 5 ml oddzielnej podwielokrotności pożywki MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME.
- Przywróć roztwór do pH 7,4 i wysterylizuj filtr za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 28 mm z sulfonu polieterowego (PES) 0,2 μm.
- Rozcieńczyć roztwór do stężenia 50 mM (2 x LME) w pożywce MEM i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC na 10 minut wraz z normalną pożywką MEM dla kultur kontrolnych.
- Usunąć połowę (250 μl) pożywki MEM z kultur CGC i zachować w temperaturze 37 °C.
- Traktować komórki pożywką MEM zawierającą 2 x LME (250 μl), tj. rozcieńczoną w stosunku 1:1, co daje stężenie studzienki 25 mM, lub wstępnie podgrzaną pożywką MEM bez LME (250 μl) dla kultur kontrolnych.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 6% CO2 przez 1 godzinę.
- Umyć komórki dwukrotnie w świeżej, wstępnie podgrzanej pożywce MEM w celu usunięcia pożywki zawierającej LME, a następnie zastąpić zatrzymaną pożywkę hodowlaną i równą objętość świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MEM do odpowiednich studzienek.
- Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (nawilżonym 6% CO2 w temperaturze 37 °C) i pozostawić na 24 godziny przed dalszym leczeniem.