Protokół pobierania tkanki mózgowej od pierwszego dnia u szczeniąt szczurów Sprague Dawley, które zostały poddane eutanazji przez dekapitację, został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Alberty.
1. Izolacja mikrogleju i astrocytów
UWAGA: Wszystkie podłoża do izolacji i hodowli komórkowej są wstępnie podgrzewane do 37 °C w łaźni wodnej. Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawiera 1% penicyliny-streptomycyny (PS). Wszystkie zmodyfikowane podłoża Eagle's firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 Hama (DMEM/F12) są uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (PS). Tylko mieszanki z trypsyną nie mają FBS. Wszystkie materiały w tym protokole są sterylne (filtr, alkohol, zakupione i autoklawowane), a każdy krok następujący po kroku 1.8 jest wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem techniki aseptycznej.
- Na mózg podgrzej wstępnie 15 ml HBSS i 12,5 ml DMEM/F12 do 37 °C w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i około 2 ml 0,25% trypsyny z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Podgrzej dodatkowe 25 ml DMEM/F12. Podgrzej trypsynę około 10 minut przed użyciem, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej.
- Wlej wystarczająco dużo ciepłego HBSS do sterylnych naczyń hodowlanych o średnicy 6 i 10 cm, aby pokryć powierzchnię. Przygotuj jedno naczynie o średnicy 10 cm na każde dwa mózgi oraz dodatkowe naczynie o średnicy 6 cm.
- Umieść do 2 mózgów w każdym naczyniu o długości 10cm2 (ryc. 1A).
- Pod mikroskopem preparacyjnym użyj zakrzywionych i prostych kleszczy, aby oddzielić korę wzdłuż linii środkowej i móżdżek od pnia mózgu. W ten sposób uzyskuje się trzy sekcje tkanki na mózg (ryc. 1B).
- Oderwij cienką, półprzezroczystą warstwę (opony mózgowe) tkanki zawierającej naczynia krwionośne z każdego odcinka tkanki i wyrzuć, przenosząc pozostałą tkankę do oddzielnego naczynia hodowlanego. Chwyć kleszczem cienkie warstwy odsłonięte przez nacięcia tkanek i ostrożnie pociągnij, aż główne części będą "zwisać" z tkanki mózgowej. Na koniec usuń tę porcję, delikatnie szarpiąc. Zobacz rysunek 1C-1E, aby zapoznać się z reprezentatywnymi obrazami przed, w trakcie i po tym kroku.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń pozostały HBSS z naczynia hodowlanego, ostrożnie zachowując tkankę. Tkankę należy zmacerować skalpelem i przenieść tkankę do wstępnie podgrzanej probówki o pojemności 15 ml z trypsyną.
- Inkubować tę probówkę przez 25 minut w kąpieli o temperaturze 37 °C w celu enzymatycznego trawienia tkanki.
- Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.
- Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj 10 ml ciepłego DMEM/F12 w celu dezaktywacji trypsyny i rozcieraj roztwór 5 razy, aby rozbić tkankę.
- Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.
- Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml zawiesić osad w 10 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 rozcierać roztwór 3 razy.
- Rozprowadź ten roztwór w porcjach po 12,5 ml ciepłego DMEM/F12 na mózg.
- Odpipetować porcje 1 ml roztartego roztworu do płytki 12-dołkowej (1 na mózg).
- Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Wymień nośnik po trzech dniach i odświeżaj nośnik co kolejne trzy dni. Po 2 tygodniach komórki można pobrać do eksperymentów.
2. Synteza makromerów
- Odważyć 375 mg soli kwasu hialuronowego (HA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 37,5 ml wody destylowanej.
- Przepłukać roztwór wirownikiem przez 1 minutę i poddać mieszaninę sonikacji, aż stanie się jednorodna i straci swoją żelową lepkość. Ten proces może potrwać 6 godzin.
- Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 100 ml z magnetycznym prętem mieszającym (38 mm) i energicznie wymieszać w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie miareczkować 5,0 M NaOH do mieszalnego HA i mierzyć za pomocą bibuły do pH, aż pH ustabilizuje się między 8 a 12.
- Zebrać 3 ml świeżego bezwodnika metakrylowego (MA, 94%), pokrytego azotem podczas przechowywania.
nuta: MA jest wystawiona na działanie atmosfery przez długi czas (dni), straci swoją reaktywność.
ostrożność: Całe użycie MA powinno odbywać się pod wyciągiem.
- Dodać 200 μl MA do roztworu kwasu hialuronowego do mieszania. Reakcja obniża pH roztworu poniżej 8.
- Powtarzać kroki od 2.4 do 2.6, aż 3 ml MA zostaną dodane do roztworu. Proces ten może potrwać do 1-2 godzin.
- Pozostawić reakcję na noc w temperaturze 4 °C, bez mieszania.
- Przenieść roztwór do 400 ml zimnego etanolu (EtOH) w zlewce o pojemności 500 ml i pozostawić na wytrącanie przez 24-72 godziny w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie zdekantować większą część roztworu do oddzielnej zlewki w celu usunięcia i zebrać osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby można go rozprowadzić w 2-4 probówkach.
- Odwirować probówki o sile 200 x g w wirówce przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Uzupełnić probówkę zimnym EtOH, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę i powtórzyć krok 2.10-2.11.
- Dodać 25 ml sterylnej wody dejonizowanej, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę, dokonywać sonikacji (>20 kHz) przez 1 godzinę i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Umieścić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 15 minut lub do momentu zamrożenia lub błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie.
ostrożność: Podczas używania ciekłego azotu należy używać rękawic ochronnych, osłony twarzy i fartucha.
- Liofilizować probówkę (poniżej 0,1 mBar i -30 °C) przez 24 - 48 godzin, aż do wytworzenia proszku przypominającego śnieg.
- W tym momencie należy zbadać próbkę pod kątem czystości za pomocą 1H magnetycznego rezonansu jądrowego, w którym można potwierdzić ilość protonów metakrylanu (szczyty przy 6,1 i 5,6 ppm) w stosunku do protonów metylu (1,9 ppm) w szkielecie HA. Dopuszczalny jest minimalny stosunek 95% metakrylanu do protonów metylu.
3. Tworzenie żelu i enkapsulacja 3D
- Przygotowanie szkiełka nakrywkowego i formy
- Przygotować 50 ml roztworu wody destylowanej 2% metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w roztworze i kołysać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jednorazowo można dodać do 50 szkiełek nakrywkowych.
- Spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno w 3 zlewkach ze 100 ml wody dejonizowanej.
- Szkiełka nakrywkowe wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 40 °C za pomocą eksykatora i piekarnika.
- Szybko zanurz poszczególne szkiełka nakrywkowe w 70% EtOH za pomocą kleszczy.
- Bez suszenia wrzuć każde szkiełko nakrywkowe do dołka z 12-dołkową płytką.
- Umyj i odessaj każdą studzienkę sterylną wodą dejonizowaną (1 ml na studzienkę).
- Dodać 1 ml sterylnej poli-L-lizyny (PLL) 2 μg / ml (PLL) do każdego dołka i inkubować przez >2 godziny.
- Odessać roztwór PLL i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.
- Zanurz formy polidimetylosiloksanu (PDMS) (patrz rysunek 2) w 70% EtOH i umieść jedną na środku każdego szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i utwórz uszczelnienie między formą a szkłem.
- Przygotuj formy PDMS, odlewając odczynniki premiksowe PDMS w stosunku 10:1 w naczyniu z polistyrenu o płaskim dnie. Ilość przygotowanego PDMS dobiera się w taki sposób, aby uzyskać arkusz o grubości około 1 mm. Aby uformować studzienki w PDMS, wytnij arkusze okrągłym dziurkaczem o średnicy wewnętrznej 10.
- Przygotowanie komórek
UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) dostosowuje się do pH 7,4 dla wszystkich etapów.
- 24 godziny przed enkapsulacją komórek w metakrylanym kwasie hialuronowym (HAMA), odświeżyć pożywkę dla 2-tygodniowych kultur pierwotnych (od kroku 1.15) na płytkach 12-dołkowych. Dodaj 1 ml pożywki DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) na dołek.
- Na każdą 12-dołkową płytkę komórek przygotować 12,5 ml rozcieńczonej trypsyny (0,25% trypsyny-EDTA rozcieńczonej 30% pożywką DMEM/F12) i 25 ml DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
- Zebrać kondycjonowaną pożywkę z płytek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml (> 0,5 ml na studzienkę), dokładnie odessać pozostały płyn i zastąpić 1 ml rozcieńczonej trypsyny (0,075% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]) na 20-30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aż zlewająca się warstwa komórek oderwie się od płytki.
- Odzyskaj zawieszony materiał komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml (wygląda jak pojedynczy pływający element) i zbierz w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć równoważną objętością DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odrzucając supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 10 ml ciepłym DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS), rozcierać komórki 5 razy za pomocą pipety 10 ml i wirować przy 200 x g przez 2 min.
- Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 należy 3 razy rozcierać roztwór komórek i przefiltrować zawiesinę przez sito komórkowe 40 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej.
- Zbierz 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńcz 1:100 w ciepłym DMEM/F12 i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
- Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do etapu kapsułkowania.
- Hermetyzacja komórek
UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Na każdą 12-dołkową płytkę hydrożeli 3D należy podgrzać 12,5 ml DMEM/F12 i 12,5 ml kondycjonowanej pożywki DMEM/F12 zebranej podczas przygotowywania komórek.
- Zważyć ilość HAMA wymaganą do uzyskania końcowego stężenia 0,5% wag./obj. Rozpuść tę HAMA w sterylnym, przefiltrowanym PBS o stężeniu (2% wag./obj.); stężenie 4 razy wyższe niż stężenie końcowe jest wykorzystywane do dodania komórek i innych odczynników. Jedna 12-dołkowa płytka hydrożeli wymaga ~350 μl PBS z 7 mg HAMA.
- Sonikować roztwory (>20 kHz) aż do całkowitego rozpuszczenia HAMA przez 60 minut.
- Przygotować indywidualne 10% roztwory zarówno trietanoloaminy (TEA), jak i 1-winylo-2-pirolidynonu (NVP) oraz 1 mM roztwór eozyny Y (EY) w 1 ml podwielokrotności sterylnego PBS o pH 7,4.
- Na jedną 12-dołkową płytkę przygotuj końcową mieszaninę 1,4 ml 1 x10 7 komórek, 0,5% wag./obj. HAMA (350 μl 2% wag./obj.), 0,1% TEA (14 μl 10%), 0,1% NVP (14 μl 10%) i 0,01 mM EY (14 μl 1 mM) i 20% mieszaniny blaszki podstawowej (280 μl bulionu). Pozostały wolumin to PBS.
- Delikatnie wymieszaj roztwór i odpipetuj 100 μl do każdej formy PDMS za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.
- Wystaw próbki na działanie zielonego światła LED o wysokiej intensywności (~520 nm, 60 mW, w zamkniętym pudełku o wymiarach 20 cm x 20 cm x 20 cm) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 1 ml na dołek ciepłego kondycjonowanego DMEM/F12 do płytki 12-dołkowej.
- Chwyć każde szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym, powoli odklej formę PDMS zakrzywioną pęsetą, uważając, aby nie przesunąć żelu i umieść go w studzience z kondycjonowanym podłożem.
- Dodaj dodatkowy 1 ml ciepłego DMEM/F12 do każdego dołka.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 tygodnie, odświeżając pożywkę komórkową co tydzień, pipetując 1 ml pożywki z każdej studzienki i zastępując ją 1 ml DMEM/F12.
