$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hodowla komórkowa i przygotowanie odczynników
- Przygotuj powlekane płytki do hodowli komórkowej.
- Rozcieńczyć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) pożywką DMEM/F12 w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Rozcieńczony roztwór podstawowy ECM rozdzielić na 30 stożkowych probówek po 3 ml każda i natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby uzyskać roztwór roboczy, należy ponownie zawiesić 3 ml materiału wyjściowego ECM w 33 ml wstępnie schłodzonego podłoża DMEM/F12, zwiększając całkowitą objętość do 36 ml dla stężenia 80 μg/ml.
- Pokryć 1 ml na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej roztworem roboczym ECM. Dodaj dodatkowy 1 ml DMEM/F12 na studzienkę (jeśli to konieczne), aby upewnić się, że powierzchnia studzienki jest w pełni pokryta. Przed użyciem pozostawić powlekane 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godzinę.
UWAGA: Powlekane płytki można przechowywać w inkubatorze lub w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
- Przygotuj preparaty pożywek, czynniki wzrostu i małe cząsteczki.
- Aby przygotować 500 ml pożywki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), dodaj 20 i 500 razy suplementów zgodnie z instrukcjami producenta.
- Aby przygotować 500 ml pożywki neuronalnej (NM), dodaj heparynę do końcowego stężenia 2 mg / ml, 1x roztwór antybiotyku/antybiotyku, 1x suplement B27 lub 1x suplement N2 do 500 ml butelki DMEM/F12 z suplementem L-glutaminy, jak opisano wcześniej.
- Aby przygotować 10 mM (1000x) roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho Y27632 (Y), dodaj 10 mg proszku do 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przefiltrować, wysterylizować, poddzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować w stężeniu roboczym 10 μM w pożywce.
- Aby przygotować 20 mM (10 000x) roztwór podstawowy SB431542, dodaj 10 mg proszku do 1,3 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Aby przygotować 2 mM (1,000x) roztwór podstawowy DMH1, dodaj 10 mg proszku do 13,1 ml DMSO. Przefiltrować, wysterylizować, naporcjować i przechowywać każdy roztwór w temperaturze -20 °C. Stosować każdy roztwór w stężeniu roboczym 2 μM w pożywkach (NM + SB431542 + DMH1).
nuta: Protokół ten zaleca 2 μM stężenia robocze zarówno SB431542, jak i DMH1 w oparciu o nasze obserwacje i raporty innych osób stwierdzające, że stężenie to skutecznie wspomaga indukcję neuronalną z hPSC. Zgłaszano również wyższe stężenia30. Dodatkowo, w przypadku alternatywnych mediów, wykazano również, że małe cząsteczki nie są niezbędne do wysokiej konwersji neuronalnej. W związku z tym stężenia robocze będą się różnić w zależności od alternatywnych środowisk hodowli komórkowych, a optymalne stężenia powinny być testowane przez indywidualnych badaczy.
- Aby przygotować pojedyncze 100 μg/ml (10 000x) roztworów podstawowych naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF2), dodaj 1 mg każdego z nich do 10 ml PBS + 0,1% BSA. Podwielokrotne roztwory podstawowe EGF i FGF2 rozdzielić na 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C. Stosować w podłożu o stężeniu roboczym 10 ng/ml; np. dodać 5 μl EGF i 5 μl FGF2 do 50 ml NM (NM + EGF + FGF2).
- Aby przygotować roztwór podstawowy chlorowodorku doksycykliny (Dox), należy najpierw rozpuścić proszek w DMSO do 100 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Następnie rozcieńczyć go w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml (1000x) w PBS i przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować w stężeniu roboczym 2 μg/ml w pożywce; np. dodać 50 μL Dox do 50 ml NM (NM + Dox).
nuta: Nie zamrażać ponownie roztworów po rozmrożeniu.
2. Generowanie podtypów neuronalnych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych (hPSC)
UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe powinny być utrzymywane w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Kultury te są utrzymywane na poziomie tlenu w pomieszczeniu, chociaż można wykorzystać niższe poziomy.
- Generowanie i utrzymywanie progenitorów astrocytów (hAstros) z hPSCs.
nuta: Ta sekcja zawiera krótki i uproszczony protokół różnicowania. Szczegółowy opis (z tworzeniem ciała zarodka, wyborem rozety i etapami tworzenia wzorców regionalnych) znajduje się w wcześniej opisanym protokole (Rysunek 1A, kropkowana zielona ramka).
- Klastry nasienne hPSC (ryc. 1B) na 6-dołkowych płytkach pokrytych ECM (patrz krok 1.1) z 2 ml pożywki hPSC + Y na studzienkę. Karm komórki macierzyste codziennie, aż osiągną około 50% zlewu i podziel się w razie potrzeby.
- Aby rozszczepić hPSC, dodaj 1 ml odczynnika pasażującego do studzienek i odessaj po 1 minutach. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, dodaj 1 ml pożywki hPSC i podziel agregaty 1:10 na nowe studzienki pokryte ECM w 2 ml pożywki hPSC + Y na studzienkę.
- Utrzymuj komórki macierzyste do momentu, gdy zlewają się w około 50%, a następnie zmień pożywkę na NM + SB431542 + DMH1, aby indukować różnicowanie neuronalne (dzień 0). Gdy komórki są w około 95% zlewne, podziel 1:6 na nowe studzienki pokryte ECM w tym samym podłożu.
- W dniu 14 należy oddzielić komórki od roztworu oddzielającego i przenieść je do niepowlekanej kolby z Y, aby pobudzić tworzenie agregatów.
nuta: Dodatek Y jest wykorzystywany do wspomagania przetrwania komórek i tworzenia kul, ale nie jest uwzględniany podczas każdego karmienia.
- Do generowania neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów (hNeurons) użyj tych komórek dnia 14, jak opisano poniżej. Alternatywnie, wykorzystaj te komórki w późniejszych punktach czasowych z kultur jednowarstwowych lub sferycznych, zanim nastąpi dojrzewanie neuronów lub rozpocznie się glejogeneza.
nuta: Domyślnie ten protokół wytwarza astrocyty grzbietowo-korowe. Jednak podtypy astrocytów można określić regionalnie poprzez dodanie morfogenów wzorcowych, jeśli jest to pożądane. Kwas retinowy (RA) może być dodawany w celu kaudalizacji komórek w fenotypach rdzenia kręgowego, podczas gdy jeż soniczny (SHH), wygładzony agonista (SAG) lub purmorfamina będą wytwarzać fenotypy brzuszne.
- W celu wytworzenia progenitorów astrocytów i astrocytów w spontanicznie utworzonych agregatach 3D (hAstrospheres), należy przełączyć się na NM + EGF + FGF2 i podawać co tydzień (lub w razie potrzeby, aby zapewnić stabilne pH), jak opisano wcześniej.
- Delikatnie rozłącz agregaty hAstro z roztworem odłączającym, gdy pojawią się ciemne centra i usuń kule, które spontanicznie się przyczepiają. Raz w tygodniu delikatnie rozbijaj kule, aby utrzymać je w zdrowiu i uniknąć nekrotycznych rdzeni.
nuta: Nie należy przekraczać 5 minut leczenia roztworem odrywającym.
- Po 4-6 miesiącach od ekspansji potwierdź tożsamość komórki i albo zamroź w pożywce do krioprezerwacji (zgodnie z instrukcjami producenta) lub w alternatywnych warunkach przechowywania w celu długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie lub natychmiast użyj do eksperymentów.
