Generowanie 3D sfer kokulturowych astrocytów i neuronów w celu indukowania tworzenia synaps

Streszczenie

Źródło: Cvetkovic, C., et al. Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje procedurę kokulturacji astrocytów i neuronów w celu utworzenia sfer 3D. Te sfery 3D stanowią odrębną platformę do badania tworzenia synaps i integracji sieci neuronowych, służąc tym samym jako potencjalny model do badań w neuronauce rozwojowej, chorobach neurodegeneracyjnych i interwencjach neurofarmakologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie i utrzymanie kokultur sfer 3D

1. Odłącz hAstros od agregatów 3D w zawieszeniu.​
   1. Delikatnie oddziel agregaty ludzkich astrocytów (hAstro) za pomocą roztworu odłączającego, gdy pojawią się ciemne centra i usuń kule, które spontanicznie się przyczepiają. Raz w tygodniu delikatnie rozbijaj kule, aby utrzymać je w zdrowiu i uniknąć nekrotycznych rdzeni.
      UWAGA: Nie należy przekraczać 5 minut leczenia roztworem odrywającym.
2. Dysocjacja hNeurons lub iNeurons od monowarstwy 2D.
   1. Usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i dodać 500 μl roztworu oddzielającego do każdej dobrze zawierającej monowarstwowej kultury hNeuron (neuron ludzki) lub iNeurons (neurony indukowalne). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Delikatnie dodaj 2-3 ml podłoża podstawowego DMEM/F12, aby usunąć przyczepione komórki.
   2. Zebrać komórki i pożywkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 1 minutę. Odessać supernatant, dodać 1 ml świeżej pożywki i delikatnie pipetować w górę i w dół mikropipetą o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
3. Formuj kule 3D za pomocą płytek do hodowli mikrostudzienek.
   1. Przygotuj płytkę, dodając 0,5 ml płynu do płukania zapobiegającego przywieraniu do każdego dołka płytki mikrodołkowej. Płytka wirówkowa o masie 2 000 x g przez 5 min. Odessać roztwór płuczący, dodać 1 ml podłoża podstawowego DMEM/F12 do każdej studzienki w celu przepłukania i ponownie odessać.
      nuta: Zawsze upewnij się, że wirówka jest wyważona podczas użytkowania.
   2. Policz każdy typ komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Dodaj żądany stosunek zdysocjowanych hAstros i hNeurons lub iNeurons do każdej studzienki w łącznej objętości 2 ml pożywki neuronowej (NM) + Y (w tym Dox, jeśli wykorzystywane są iNeurony). Odwirować płytkę o masie 100 x g przez 3 minuty i ponownie umieścić w inkubatorze.
      UWAGA: 24-dołkowe płytki mikrodołkowe (patrz Tabela materiałów) zawierają 300 mikrostudzienek na studzienkę. Dodać minimum 6 x 10⁵ komórek (dla kulek po 2 x 10 po³ komórki każda) i maksymalnie 6 x 10⁶ komórek (dla kulek po 2 x 10⁴ komórki każda) w 2 ml pożywki na basenik. W przypadku żywotnych sfer o określonej gęstości w tym zakresie, użyj określonej liczby komórek i podziel przez 300, aby obliczyć liczbę komórek na kulę. W razie potrzeby można również zastosować alternatywne metody i narzędzia do formowania kul. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać dopuszczalne zakresy gęstości komórek.
   3. Pozwól komórkom samoorganizować się w gęsto upakowane kulki w płytkach mikrodołkowych w ciągu następnych 2 dni (ryc. 1A). Wymień 50% pożywki, jeśli kultura żółknie.
      nuta: Podczas wyjmowania i dodawania mediów należy delikatnie wymieniać tylko połowę podłoża i pipetować, aby nie zakłócać pracy sfer. Kule mogą unosić się z mikrostudzienek i łączyć się ze sobą z większą siłą.
   4. Po 2 dniach delikatnie wyjmij kulki z mikrostudzienek za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl (rysunek 2D). Lekko przyłóż siłę do dna mikrostudzienek z mediami, aby usunąć wszelkie dodatkowe przylegające kulki. Pozwól kulkom osiąść w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odessaj stare podłoże i dodaj świeże podłoże.
4. Skonfiguruj system bioreaktora z kolbą obrotową do formowania kul 3D.​
   1. Oczyść powierzchnię mieszadła magnetycznego 70% etanolem i umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych. Autoklaw poszczególnych kolb obrotowych do sterylizacji.
   2. Dodać kulki z pożywką o minimalnej objętości 50–60 ml do każdej kolby obrotowej (Rysunek 2D, wstawka). Umieścić kolbę na magnetycznej płytce mieszającej ustawionej na 60 obr./min. Kulki hodowlane w kolbach obrotowych, aż będą gotowe do zbierania danych.
      nuta: Do utworzenia synaps potrzebne są co najmniej 3 tygodnie w hodowli.

Wyniki

Rysunek 1: Systematyczne i powtarzalne generowanie bioinżynieryjnych sfer neuronowych 3D. (A) Płytki hodowlane Microwell (μ-well) są używane do tworzenia sfer neuronowych 3D o pożądanej gęstości i stosunku neuronów do astrocytów w sposób systematyczny i określony przez użytkownika, uzyskując spójny rozmiar i kształt. Obrazy są wyświetlane 1 dzień po uformowaniu się sfery. Podziałka ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 6-dołkowa	Fisher Naukowy	08-772-1B
Probówki stożkowe 15 ml	Olympus Plastics	28-101
Dokładności	Sigma	A6964-100ML	Rozwiązanie do odłączania
Płyta AggreWell	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 34850
Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu	Technologie komórek macierzystych	Zobacz materiał 7010	Zapobiegaj przywieraniu komórek do płytek mikrodołkowych
Anty/anty	Rybak termiczny	15240062
B27	Rybak termiczny	17504044	Dodatek dla mediów
Pożywka neuronalna BrainPhys	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 5790	Neurofizjologiczna alternatywa dla podłoża podstawowego
DMEM/F12	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 10565-042	Z suplementem GlutaMAX
DMH-1	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 73634	ZAGROŻENIE: Toksyczny w przypadku połknięcia. Stężenie robocze: 2 uM
Serum osła	Laboratoria Biologiczne Lampire	Numer katalogowy: 7332100	Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym
Chlorowodorek doksycykliny (Dox)	Sigma	D3072-1ml	ZAGROŻENIE: Działa toksycznie dla kobiet w ciąży. Stężenie robocze: 2 ug/ml
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Stężenie robocze: 10 ng/ml
Czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF)	Peprotech	100-18 mld	Stężenie robocze: 10 ng/ml
Hemacytometr lub automatyczny licznik komórek	Technologie życiowe	AMQAX1000
Matrigel membrana matrycowa	Corning	Numer telefonu 354230	Rozwiązanie do powlekania ECM. Stężenie robocze: 80 ug/ml. Przygotuj na lodzie i upewnij się, że pipety, probówki i media są wstępnie schłodzone.
System MEA 2100	Systemy wielokanałowe	MEA2100
Inhibitor kinazy Rho Y27632- (Y)	Tocris powiedział:	1254	Stężenie robocze: 10 uM
SB431542	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 72234	Stężenie robocze: 2 uM
Kolby obrotowe	Fisher Naukowy	Nr kat. 4500-125
Kolba hodowlana T25	Olympus Plastics	25-207	Wentylowane nasadki
Trypan niebieski	Invitrogen	Zobacz materiał T10282

TGL powiedział: szt.