Generowanie 3D sfer kokulturowych astrocytów i neuronów w celu indukowania tworzenia synaps

Streszczenie

Źródło: Cvetkovic, C., et al. Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje procedurę kokulturacji astrocytów i neuronów w celu utworzenia sfer 3D. Te sfery 3D stanowią odrębną platformę do badania tworzenia synaps i integracji sieci neuronowych, służąc tym samym jako potencjalny model do badań w neuronauce rozwojowej, chorobach neurodegeneracyjnych i interwencjach neurofarmakologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie i utrzymanie kokultur sfer 3D

1. Odłącz hAstros od agregatów 3D w zawieszeniu.​
   1. Delikatnie oddziel agregaty ludzkich astrocytów (hAstro) za pomocą roztworu odłączającego, gdy pojawią się ciemne centra i usuń kule, które spontanicznie się przyczepiają. Raz w tygodniu delikatnie rozbijaj kule, aby utrzymać je w zdrowiu i uniknąć nekrotycznych rdzeni.
      UWAGA: Nie należy przekraczać 5 minut leczenia roztworem odrywającym.
2. Dysocjacja hNeurons lub iNeurons od monowarstwy 2D.
   1. Usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i dodać 500 μl roz....

Wyniki

Rysunek 1: Systematyczne i powtarzalne generowanie bioinżynieryjnych sfer neuronowych 3D. (A) Płytki hodowlane Microwell (μ-well) są używane do tworzenia sfer neuronowych 3D o pożądanej gęstości i stosunku neuronów do astrocytów w sposób systematyczny i określony przez użytkownika, uzyskując spójny rozmiar i kształt. Obrazy są wyświetlane 1 dzień po uformowaniu się sfery. Podziałka .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 6-dołkowa	Fisher Naukowy	08-772-1B
Probówki stożkowe 15 ml	Olympus Plastics	28-101
Dokładności	Sigma	A6964-100ML	Rozwiązanie do odłączania
Płyta AggreWell	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 34850
Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu	Technologie komórek macierzystych	Zobacz materiał 7010	Zapobiegaj przywieraniu komórek do płytek mikrodołkowych
Anty/anty	Rybak termiczny	15240062
B27	Rybak termiczny	17504044	Dodatek dla mediów
Pożywka neuronalna BrainPhys	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 5790	Neurofizjologiczna alternatywa dla podłoża podstawowego
DMEM/F12	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 10565-042	Z suplementem GlutaMAX
DMH-1	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 73634	ZAGROŻENIE: Toksyczny w przypadku połknięcia. Stężenie robocze: 2 uM
Serum osła	Laboratoria Biologiczne Lampire	Numer katalogowy: 7332100	Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym
Chlorowodorek doksycykliny (Dox)	Sigma	D3072-1ml	ZAGROŻENIE: Działa toksycznie dla kobiet w ciąży. Stężenie robocze: 2 ug/ml
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Stężenie robocze: 10 ng/ml
Czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF)	Peprotech	100-18 mld	Stężenie robocze: 10 ng/ml
Hemacytometr lub automatyczny licznik komórek	Technologie życiowe	AMQAX1000
Matrigel membrana matrycowa	Corning	Numer telefonu 354230	Rozwiązanie do powlekania ECM. Stężenie robocze: 80 ug/ml. Przygotuj na lodzie i upewnij się, że pipety, probówki i media są wstępnie schłodzone.
System MEA 2100	Systemy wielokanałowe	MEA2100
Inhibitor kinazy Rho Y27632- (Y)	Tocris powiedział:	1254	Stężenie robocze: 10 uM
SB431542	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 72234	Stężenie robocze: 2 uM
Kolby obrotowe	Fisher Naukowy	Nr kat. 4500-125
Kolba hodowlana T25	Olympus Plastics	25-207	Wentylowane nasadki
Trypan niebieski	Invitrogen	Zobacz materiał T10282

TGL powiedział: szt.